细胞外Ca2+浓度的变化对人晶状体上皮细胞内质网应激影响的研究

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目的:本研究拟用改变细胞外Ca2+浓度的方法,探讨内质网应激(ehdoplasmicreticulum stress,ERS)及其介导的凋亡在白内障中的可能发病机制。方法:1.采用不同浓度钙培养液(正常培养液、增加钙浓度1.0、5.0、7.5、10.0、15.0、20.0、25.0mmol/L培养液)培养人LECs24h。采用Flou-3钙荧光探针负载后应用流式细胞术观察细胞内游离Ca2+浓度的变化。2.应用免疫荧光(IF)技术及蛋白免疫印迹(Western Blot)法检测细胞外Ca2+浓度变化对calpain-2表达的影响。3. Western Blot方法测细胞外Ca2+浓度变化对GRP78、caspase-12表达的影响。4.采用DAPI染色法观察细胞核的形态学变化,分析细胞外Ca2+浓度变化对细胞凋亡率的影响。结果:1.流式细胞术示钙处理组细胞内Ca2+平均荧光强度值增高。随着培养液Ca2+浓度增加,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。2.免疫荧光及Western blot显示,随着培养液Ca2+浓度升高,calpain-2表达逐步增高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。3. Western Blot结果显示,GRP78、caspase-12蛋白的表达较未处理组逐渐升高,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)。4. DAPI显示钙处理组细胞随着培养液Ca2+浓度升高,细胞核表现出典型的凋亡形态学特征的细胞数增多。培养液增加钙浓度为1.0mmol/L时,细胞凋亡率无明显变化,与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);培养液增加钙浓度为5.0mmol/L,凋亡率增高,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);随着培养液Ca2+浓度进一步增高,凋亡率升高,各组与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。5.钙处理组细胞内游离Ca2+增高的程度与GRP78的表达呈正相关r=0.952,P<0.05;凋亡率与calpain-2及caspase-12的表达呈正相关,r值分别为0.912,0.940,P值都小于0.01。结论:1.体外培养的人LECs外Ca2+浓度升高,细胞内游离Ca2+增多,calpain-2表达增高。2.体外培养的人LECs外Ca2+浓度轻度升高,激活了calpain-2以及内质网应激,但是尚未对细胞的凋亡产生影响;细胞外Ca2+浓度异常增高,细胞内质网应激无法适应,细胞发生凋亡。3.细胞外Ca2+浓度增高时,诱导的内质网应激激活了calpain-2以及caspase-12传导系统从而导致晶状体上皮细胞凋亡的发生,这可能是白内障的发病机制之一。
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