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根据抗铜特性和使用活性染色方法,从武汉武昌黄金桥山和江汉油田附近多年生树木根部土壤中筛选到四株具漆酶活力的细菌。凝胶活性染色表明它们都能够氧化漆酶底物DMP和ABTS,但不能氧化酪氨酸。
利用16SrDNA序列分析法,结合常规细菌形态学分析,对四株细菌进行鉴定,确定菌株531和575属于赫氏菌属(Ochrobactrum),菌株593属于假单胞菌属(Pseudomonas),而菌株601属于克雷伯氏菌属(Klebsiella),并分别将这四株细菌命名为Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575、Pseudomonassp.593和Klebsiellasp.601。
Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575和Pseudomonassp.593三个菌株的漆酶活性需要铜离子的诱导,其铜离子的诱导作用不能被Ca2+、Mn2+、Zn2+、Fe2+、和Mg2+代替。Klebsiellasp.601菌株的漆酶活性需要铜离子的诱导,相同浓度的Ca2+、Mn2+、Fe2+、和Mg2+具有相似的诱导作用,但Zn2+则没有诱导作用。在使用LB培养基培养细菌时,诱导细菌产生漆酶需要在培养基中加入大于50μMCuSO4。当培养基中铜离子浓度超过400μM时,细菌生长变慢,显示高浓度铜离子对细菌生长有抑制作用。
活性染色时染色液的pH对四株细菌漆酶的活性有明显的影响。胶内活性染色分析表明,当使用DMP作底物时,Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.601在pH5.0到pH7.5之间显示酶活性。当染色液pH低于5.0时,不显示DMP-氧化活性。用ABTS作底物时,Ochrobactrumsp.531、Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.593仅在pH4.0-4.5之间显示漆酶活。当染色液pH大于4.5则不显示酶活性。与上述三株细菌酶活不同,无论是用DMP还是ABTS作底物,Pseudomonassp.593在pH5.0到7.0范围内,都显示酶的氧化活性,并在pH6.0处显示最强的酶活力。无论是DMP还是ABTS用作底物,对照用的蘑菇粗提液只在pH4.0左右显示漆酶活力。当pH大于4.5时则不显示酶活性。
分别用4-100℃的不同温度处理四株细菌粗提物30分钟,然后在pH5.0条件下进行DMP胶内活性染色。结果显示:(1)四株细菌在均能耐受60℃高温处理。2以4℃时的酶活性为100﹪酶活力。在60℃处理3小时,Ochrobactrumsp.531和Ochrobactrumsp.575仍保持50﹪以上酶活力,而Ochrobactrumsp.575和Klebsiellasp.601在70℃处理30分钟仍保持40﹪酶活。(2)四株细菌粗提物分列在pH3-10的不同条件下透析20小时,然后在pH5.0条件下进行胶内DMP-氧化活性染色。在pH5.0-10.0处理条件下,Ochrobactrumsp.531和Ochrobactrumsp.575细菌漆酶仍保持80﹪酶活;pH6.0-10.0条件下处理,Pseudomonassp.593细菌漆酶的相对活性在80﹪以上;pH5.0-10.0条件下处理,Klebsiellasp.601细菌漆酶也保持70﹪以上漆酶活力,且在pH3.0-4.0处理条件下,仍然保持30﹪以上酶活。
使用硫酸铵沉淀、Q-Sepharose层析和凝胶回收方法,对四株细菌进行了初步纯化。部分纯化的四株细菌漆酶蛋白质经SDS-PAGE分离,估测的蛋白的分子量:Ochrobactrumsp.531约为38.7kD,Ochrobactrumsp.575为42.6kD,Pseudomonassp.593为45kD,Klebsiellasp.601为55kD。
四株细菌所分泌漆酶蛋白为胞质可溶的单体蛋白,这些酶能耐受一定的高温和高pH处理。细菌漆酶的这些酶学性质在现代生物技术中将是非常有用的。