【摘 要】
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5-氨基乙酰丙酸（ALA）是血红素、叶绿素、维生素B12合成的必需前体,作为一种高附加值化合物,在农业和医药等领域应用广泛。近年来,利用关键酶挖掘和代谢工程改造构建工程菌,通过微生物发酵法合成ALA已经取得一定进展,然而很少有研究关注高浓度ALA对宿主菌的毒性以及菌体对ALA的响应。本课题首次系统解析了大肠杆菌对ALA的耐受机制,主要研究内容和结果如下:首先,本研究检测了初始添加高浓度ALA对大肠
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5-氨基乙酰丙酸（ALA）是血红素、叶绿素、维生素B12合成的必需前体,作为一种高附加值化合物,在农业和医药等领域应用广泛。近年来,利用关键酶挖掘和代谢工程改造构建工程菌,通过微生物发酵法合成ALA已经取得一定进展,然而很少有研究关注高浓度ALA对宿主菌的毒性以及菌体对ALA的响应。本课题首次系统解析了大肠杆菌对ALA的耐受机制,主要研究内容和结果如下:首先,本研究检测了初始添加高浓度ALA对大肠杆菌生长的影响,结果发现在15 g/L ALA胁迫下细胞初始比生长率降低了 36%,18 g/L ALA胁迫下细胞生长完全停止;膜完整性和细胞形态检测结果显示,15 g/L ALA胁迫下有52.6%的菌体细胞膜受到不同程度破坏,同时菌体形态变得更加细长,上述结果表明高浓度ALA对大肠杆菌具有较高的细胞毒性。其次,本研究检测了 ALA胁迫下大肠杆菌胞内活性氧（ROS）的产生及其在ALA细胞毒性中的作用。结果显示在15 g/L ALA胁迫下大肠杆菌胞内ROS提高了 3.4倍,添加抗氧化剂谷胱甘肽后胞内ROS水平大幅下降,同时菌体恢复正常生长,表明ROS是高浓度ALA对大肠杆菌细胞毒性的主要原因;进一步通过添加过氧化氢酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）,发现胞内ROS分别降低44%和62%,细胞生长均恢复,表明过氧化氢（H2O2）和超氧阴离子（O2·-）是ALA产生的主要ROS类型。第三,本研究检测了 ALA胁迫下大肠杆菌抗氧化系统的响应。结果显示在15 g/L ALA条件下CAT和SOD的酶活分别提高了 2.5倍和91%。同时,缺失CAT和SOD后菌体对ALA的敏感性明显增加,过表达CAT和SOD分别可以使菌体耐受30 g/L和18 g/L的ALA,表明大肠杆菌抗氧化系统在ALA耐受过程中发挥重要的作用。最后,将上述强化菌株抗氧化系统的策略用于ALA工程菌的构建,摇瓶发酵结果显示katG,sodA,sodB和sodC基因过表达后ALA产量分别比对照菌株提高了 13%,65%,28%,38%和36%,表明强化抗氧化系统能够有效提高ALA的产量;进一步在5 L发酵罐中测试KatE和SodB过表达菌株,ALA产量达到了 9.6 g/L和8.7 g/L,分别比对照菌株提高了 81%和64%,细胞生长显著改善（分别提高了 56%和28%）;组合过表达katE和sodB基因,5 L发酵罐水平重组菌株ALA产量达到11.5 g/L,比出发菌株提高了 1.2倍,是目前一步发酵法合成ALA的最高产量。通过本工作的研究明确了 ALA产生的ROS严重影响大肠杆菌的生理代谢,抗氧化系统在大肠杆菌耐受ALA过程中发挥关键作用,并通过过表达抗氧化基因提高了工程菌株对ALA的耐受性以及ALA的产量,为ALA高产菌株的设计构建提供了新思路。
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