论文部分内容阅读
葡萄是非常古老的经济果树之一,栽培历史悠久,分布地域广泛,品种资源非常丰富。随着近代农业科学的迅速发展,栽培面积日趋扩大,然而,栽培品种却日趋狭窄,对葡萄的遗传特性的了解由于葡萄高度杂合、近交抑制、相对较长的幼年期等,其系统研究尚显不足。上世纪50年代末,才开始加强葡萄的遗传学研究。近年由于分子生物学的发展,分子标记技术已在葡萄遗传学研究方面取得了显著成果。本研究在建立和优化葡萄SSR反应分析体系的基础上,应用SSR分子标记对39份葡萄品种的遗传多样性进行了研究,在分子水平上葡萄种质资源鉴定和品种亲缘关系分析提供依据,对SSR分子标记技术应用于葡萄品种鉴定和品种权保护的可行性进行了评价。主要研究结果如下:（1）在传统CTAB法的基础上,将分别加入酚的结合剂（PVP 20%）和抗氧化剂（β—巯基乙醇）两类方法组合起来有效去除多酚类杂质,这种改良的CTAB法试用于葡萄基因组DNA的提取,制备的DNA无凝胶状物质、蛋白质和酚类物质,适于PCR扩增。（2）确定了适合葡萄SSR反应的体系为:模板DNA为20～30ng,Mg2+1.5mmol/L,dNTP 0.2mmol/L,Taq DNA聚合酶1U,Primer 0.5umol/L,总体积为20ul,剩下的用ddH2O来补充;确定了适合葡萄SSR反应扩增程序为:95℃预变性4min,95℃变性50s,50～60℃退火1min,72℃延伸1min30s,30个循环,72℃延伸7min。（3）从22对引物中筛选出能稳定扩增的12对引物,用12对SSR引物比较了39个葡萄品种的遗传多样性。结果表明,12对引物在上述品种中共扩增出155条DNA谱带,其中多态性带有149条,占扩增总带数的96.13%,特异性条带8条,占5%,所扩增的片段大小在50～1000bp之间,不同引物扩增的带数在5～24之间,平均12.9条,其中扩增条带最多的是引物VrZAG67,扩增出24条带;最少的是VrZAG47,仅扩增了5条带。（4）对葡萄属39个品种及类型进行了SSR扩增,应用NTSYS软件进行遗传相似系数计算,品种间遗传相似系数变异在0.368～1.000之间,利用UPGMA法构建聚类树状图,在相似系数为0.660的阈值下,可将39份材料分为3大类群:第1类包括格拉卡和美人指两个品种;第2类包括玫瑰香、红旗特早、达米娜、玫瑰玉、红玫瑰等;第3类包括京云、奥古斯特、无核早红、巨峰等。（5）建立了巨峰、高路比、格拉卡等品种的DNA指纹图谱,找到了它们的特异谱带,利用不同的引物组合,根据DNA指纹和特异谱带,可将39个参试品种鉴别出来。（6）SSR技术在葡萄品种鉴定和纯度分析上应用的可行性分析。本研究结果表明:葡萄品种间的遗传多态性有明显差异,即使父母本相同的品种,也能分开。如“京云”和“奥古斯特”同为意大利和葡萄园皇后的杂交后代,利用SSR技术很容易分开。