肉品腐败变质给人类的食品供应带来了极大的危害。据统计，每年因各种原因造成的肉品浪费和损失高达2.63亿吨。由于肉品营养物质丰富、水分含量大，是微生物生长繁殖的天然培养基，同时肉品在屠宰、加工过程中工序繁琐、肉质与外界物质接触机会多，交叉污染导致其中的微生物污染水平居高不下。控制微生物污染水平，延缓肉品腐败变质已成为本领域国内外面临的共同挑战。目前已经证明气调包装(CO2/N230％/70％)可以有效抑制冷鲜肉中微生物的生长。综合考虑成本和保鲜效果，应用气调包装是目前冷鲜肉推广和产业发展过程中的大趋势。因此，深入研究气调包装对腐败菌致腐效应的抑制机制，对针对性制定冷鲜肉品保鲜策略具有重大意义。基于目前的研究现状以及存在的问题，本研究针对肉源性强致腐莓实假单胞菌，以鸡胸肉切片为生长基质，比较研究了莓实假单胞菌在托盘包装和气调包装下菌体生理生化特性与代谢活动的变化趋势，同时借助高通量测序技术筛选分析出气调包装中细菌致腐相关的基因表达规律，利用分子生物学技术研究了特定基因的功能，揭示了气调包装抑制莓实假单胞菌致腐效应的作用机制。具体研究内容和结果如下:
　　1.冷鲜鸡肉中腐败菌的筛选和腐败潜能评估
　　基于细菌分解鸡肉的能力自制一种选择性培养基，鸡肉肉汤琼脂(Raw-chicken Juice Agar,RJA)，利用该培养基从冷鲜鸡肉中分离到属于3个属和7个种的53株菌。从中挑选出3株分解圈较大的腐败菌杀鲑气单胞菌35、荧光假单胞菌H5、莓实假单胞菌NMC25，同时结合一株实验室前期保存的常见腐败菌液化沙雷氏菌17，研究它们的胞外蛋白酶活性并评估它们在鸡胸肉切片上的腐败潜能。结果表明:杀鲑气单胞菌35对肌浆蛋白和肌原纤维蛋白有最强的分解能力，莓实假单胞菌NMC25次之:在鸡胸肉切片上培养时莓实假单胞菌NMC25表现出较强致腐能力，具体表现为生长速度快、加速鸡肉中挥发性盐基氮与pH变化、产生粘液。此外，在冷藏期间所有腐败菌都产生了多种挥发性化合物，包括醇、醛、酮和硫化物等。综合本章结果，发现莓实假单胞菌NMC25在4种腐败菌中的致腐能力最强:本章中自制的RJA培养基为后续研究中评估腐败菌的腐败潜能提供了一种简便有效的方法。
　　2.气调包装对不同莓实假单胞菌分离株腐败能力的影响
　　根据前一章试验结果，选择不同的莓实假单胞菌株作为研究对象，分别以气调包装(处理组)和托盘包装(对照组)为生长环境，研究在最适温度、TSB(标准培养基)中生长的莓实假单胞菌腐败相关理化性质的变化。结果表明:不同莓实假单胞菌在RJA上产生的分解圈大小不同，但在气调包装下均无分解圈产生:气调包装抑制莓实假单胞菌生长中的对数期，随着培养时间的延长，这种抑制效果对产分解圈菌株逐渐消失。其中分离株2和NMC25在稳定期的生长反超对照组:分离株2和NMC25具备较强的生物菌膜形成能力，但在气调环境下受到了显著的抑制:不同莓实假单胞菌表面特性均出现了显著变化，包括运动性下降、聚集性和疏水性增强:扫描电子显微镜观察到气调包装下出现大量菌体聚集，形成了具有一定空间结构的聚集体:莓实假单胞菌对气调包装的应激响应具有菌体特异性，这些应答可以促使莓实假单胞菌在气调环境下的存活和生长。这些结果表明，不同致腐能力的莓实假单胞菌在气调包装中的性质变化程度受到菌体特异性的影响:但气调包装均能抑制它们分解鸡肉的能力，说明气调包装会影响莓实假单胞菌的代谢活动，这很可能与气调包装抑制其致腐效应的作用机制有关。
　　3.气调包装下原位培养莓实假单胞菌的表观生理变化
　　根据前一章试验结果，选择强腐败菌NMC25作为研究对象，通过测定胞外聚合物性质、膜完整性、膜电位、胞内ATP含量和胞外蛋白酶活性，研究莓实假单胞菌在气调包装鸡胸肉切片(原位培养)中代谢活动发生的表观变化，初步揭示气调包装抑制莓实假单胞菌致腐效应的作用机制。结果表明:气调包装抑制了原位培养下莓实假单胞菌的整个生长过程，改变了其胞外聚合物的含量、组分和性质:不同包装条件下莓实假单胞菌产生的胞外聚合物均会抑制其他种属细菌的生长和生物菌膜形成:气调包装中细菌保持了细胞膜完整性，但跨膜转运能力和胞内ATP含量显著降低:托盘包装样品的胞外蛋白酶作用于鸡肉蛋白后，从中鉴定出来源于两种肌肉结构蛋白(肌球蛋白和肌动蛋白)的多个肽段，表明这些肽段由细菌的蛋白分解活动产生:而气调包装样品对鸡肉蛋白并无分解作用，表明此状态下细菌无胞外蛋白酶活性。这些结果说明，气调包装确实影响了莓实假单胞菌的代谢活动，其中对营养物质的跨膜转运、胞内ATP水平和胞外的蛋白酶活性在细菌的致腐过程中均发挥了重要的作用。
　　4.气调包装下原位培养莓实假单胞菌的基因表达变化
　　通过全基因组测序获得第一株肉源性莓实假单胞菌NMC25的基因组完成图信息，随后通过转录组测序研究了该菌在气调包装鸡胸肉切片(原位培养)中的全局性基因表达规律，深入揭示气调包装抑制莓实假单胞菌致腐效应的作用机制。结果表明:莓实假单胞菌的基因表达模式在不同气体环境下大不相同，气调包装组中共发现559个差异表达基因:电子传递链中nuoAB基因表达显著下调，导致有氧呼吸受到抑制:气调包装显著抑制了ABC转运蛋白、鞭毛、和I型菌毛蛋白、DNA复制和修复相关基因的表达下调，进一步影响了细菌的营养摄入、运动性和生长能力:影响能量产生、氨基酸合成、膜脂质组成的相关基因表达发生显著变化，表明莓实假单胞菌可以通过调整相应的代谢活动来适应气调环境。此部分结果表明，莓实假单胞菌通过调控多种功能基因的表达模式，可以使自身在气调包装中存活和生长，但却失去了部分与致腐相关的代谢能力。
　　5.致腐相关基因的功能验证
　　根据上一章试验结果。选择两个可能在细菌致腐过程中起作用的关键基因aprD和nuoB，构建莓实假单胞菌AaprD缺失株和AnuoB缺失株来验证这两个基因的功能，并评估了这两株突变株对内品的致腐效应。结果表明:与野生株相比，在TSB中，两株突变株的生长速率和最大生长数量均显著降低，AaprD缺失株最低，AnuoB缺失株次之:在鸡胸肉切片中，AaprD缺失株的生长情况与野生株无显著差异，AnuoB缺失株细菌数量仍然显著降低，表明aprD基因对细菌生长能力的影响与培养基质有关，nuoB基因能够直接影响细菌的生长能力:AaprD缺失株在RJA培养基中并没有产生明显的分解圈，AnuoB缺失株的分解圈产生情况与野生株类似，表明aprD基因在莓实假单胞菌蛋白酶分泌过程中至关重要:AaprD缺失株的swimming和swaming泳动性与AnuoB缺失株均呈现相反的趋势:接种两种突变株的鸡胸肉切片腐败后的感官变化与野生株并无明显差异。这些结果表明，单一基因功能缺失对莓实假单胞菌的整体腐败能力影响不大，莓实假单胞菌的腐败能力受到多种功能基因的协同调控，气调包装环境同时影响了多种基因才导致了对莓实假单胞菌致腐效应的抑制，其中aprD和nuoB基因在细菌生长、扩散和蛋白酶分泌过程中发挥了重要的作用。