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哺乳动物胚胎着床包括胚胎与子宫内膜间的识别、定位、黏附及侵袭等过程,此过程极其复杂而又精细,需要子宫内膜和胚胎在时空上的同步协调,即“着床窗口期”。囊胚和子宫内膜之间的相互作用对于植入是至关重要的。人类早期的妊娠失败通常是由于在胚胎植入之前、植入过程中或植入之的发育缺陷而引起的。
PITX2(paired like homeodomain2,PITX2),是同源结构域转录因子家族之成员,在胚胎发育中具有重要功能,还参与了细胞的生长与分化等多种功能,影响包括神经干细胞、成肌细胞前体和造血干细胞等许多干细胞的行为。Wnt信号转导级联控制着所有动物的发育和成年生活中的各种生物现象。Wnt蛋白在动物的组织模式和多细胞动物的进化起源发挥着关键作用,同时,Wnt信号异常是人类多种疾病的基础。
一、目的
1、通过免疫组织化学染色检测人子宫内膜增生期和分泌期,PITX2的表达情况;
2、通过免疫组织化学染色方法,检测小鼠妊娠D1-D6子宫子宫内膜中PITX2的差异表达;
3、检测PITX2在高低接受状态子宫内膜细胞系中表达情况;
4、通过调节子宫内膜高低接受态细胞中PITX2的表达,观察细胞的功能变化及胚胎着床情况,进而探索PITX2影响胚胎着床的分子机制;
5、通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,观察在子宫内膜高低接受状态细胞中miR-21-5p与PITX2靶向调节关系。
二、方法
为探讨PITX2对子宫内膜容受性的调控作用及机制,本研究收集人增生期与分泌期子宫内膜,通过免疫组化方法检测PITX2的表达;收集妊娠D1-D6小鼠子宫内膜,通过免疫组化与Real-time PCR分析PITX2的表达变化;妊娠D3小鼠通过子宫角注射PITX2siRNA,妊娠D9小鼠收取子宫并统计胚胎着床率;体外以RL95-2细胞模拟高接受状态子宫内膜,以HEC-1A细胞模拟低接受状态子宫内膜,分析PITX2在高低接受态子宫内膜中表达差异;以JAR细胞模拟胚胎,下调RL95-2细胞或上调HEC-1A细胞中PITX2表达,检测JAR对RL95-2细胞与HEC-1A细胞的黏附作用;通过CCK-8实验、Transwell检测PITX2对子宫内膜容受性模型细胞增殖、迁移及侵袭的影响;通过Western blot实验检测Wnt/β-catenin信号通路及下游分子的变化。通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,检测子宫内膜高低接受态细胞中PITX2基因的表达情况。
三、结果
研究结果显示,在人增生期与分泌期子宫内膜中,PITX2在分泌期高于增生期表达;在妊娠小鼠D1-D6的子宫内膜中,PITX2的表达呈现D1-D4的表达逐渐增多,D4-D6逐渐减少,在D4出现峰值;子宫角注射PITX2siRNA,妊娠D9统计小鼠胚胎着床率下降,提示PITX2可能在胚胎着床过程中发挥着重要作用。
PITX2在高低接受态子宫内膜模型细胞中表达存在差异,在高接受态子宫内膜RL95-2细胞中的表达高于低接受态子宫内膜HEC-1A细胞;以PITX2过表达质粒上调HEC-1A细胞PITX2表达,能够促进细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进JAR细胞对HEC-1A的黏附作用;以PITX2siRNA下调RL95-2细胞中PITX2表达,能够抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力并可以抑制JAR细胞对HEC-1A的黏附作用。同时检测到上调PITX2后,Wnt/β-catenin信号通路及下游基因Wnt3a、β-catenin、FOXM1、MYC、Cyclin D1等蛋白表达均呈现增高的趋势,相反则降低,表明PITX2可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路进而调节细胞行为。通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,发现miR-21-5p靶向负调节PITX2的表达。
四、结论
1.PITX2在临床分泌期子宫内膜高表达;
2.PITX2在妊娠小鼠着床窗口期子宫内膜高表达,抑制PITX2可抑制胚胎着床率;
3.PITX2在高低接收状态子宫内膜细胞系中存在表达差异;
4.调控子宫内膜细胞PITX2表达可影响子宫内膜增殖、迁移、侵袭能力,并影响Wnt/β-catenin信号通路及下游基因,来调控子宫内膜的容受性建立,进而影响胚胎着床;
5.miR-21-5p对PITX2的表达具有靶向负调控作用。
PITX2(paired like homeodomain2,PITX2),是同源结构域转录因子家族之成员,在胚胎发育中具有重要功能,还参与了细胞的生长与分化等多种功能,影响包括神经干细胞、成肌细胞前体和造血干细胞等许多干细胞的行为。Wnt信号转导级联控制着所有动物的发育和成年生活中的各种生物现象。Wnt蛋白在动物的组织模式和多细胞动物的进化起源发挥着关键作用,同时,Wnt信号异常是人类多种疾病的基础。
一、目的
1、通过免疫组织化学染色检测人子宫内膜增生期和分泌期,PITX2的表达情况;
2、通过免疫组织化学染色方法,检测小鼠妊娠D1-D6子宫子宫内膜中PITX2的差异表达;
3、检测PITX2在高低接受状态子宫内膜细胞系中表达情况;
4、通过调节子宫内膜高低接受态细胞中PITX2的表达,观察细胞的功能变化及胚胎着床情况,进而探索PITX2影响胚胎着床的分子机制;
5、通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,观察在子宫内膜高低接受状态细胞中miR-21-5p与PITX2靶向调节关系。
二、方法
为探讨PITX2对子宫内膜容受性的调控作用及机制,本研究收集人增生期与分泌期子宫内膜,通过免疫组化方法检测PITX2的表达;收集妊娠D1-D6小鼠子宫内膜,通过免疫组化与Real-time PCR分析PITX2的表达变化;妊娠D3小鼠通过子宫角注射PITX2siRNA,妊娠D9小鼠收取子宫并统计胚胎着床率;体外以RL95-2细胞模拟高接受状态子宫内膜,以HEC-1A细胞模拟低接受状态子宫内膜,分析PITX2在高低接受态子宫内膜中表达差异;以JAR细胞模拟胚胎,下调RL95-2细胞或上调HEC-1A细胞中PITX2表达,检测JAR对RL95-2细胞与HEC-1A细胞的黏附作用;通过CCK-8实验、Transwell检测PITX2对子宫内膜容受性模型细胞增殖、迁移及侵袭的影响;通过Western blot实验检测Wnt/β-catenin信号通路及下游分子的变化。通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,检测子宫内膜高低接受态细胞中PITX2基因的表达情况。
三、结果
研究结果显示,在人增生期与分泌期子宫内膜中,PITX2在分泌期高于增生期表达;在妊娠小鼠D1-D6的子宫内膜中,PITX2的表达呈现D1-D4的表达逐渐增多,D4-D6逐渐减少,在D4出现峰值;子宫角注射PITX2siRNA,妊娠D9统计小鼠胚胎着床率下降,提示PITX2可能在胚胎着床过程中发挥着重要作用。
PITX2在高低接受态子宫内膜模型细胞中表达存在差异,在高接受态子宫内膜RL95-2细胞中的表达高于低接受态子宫内膜HEC-1A细胞;以PITX2过表达质粒上调HEC-1A细胞PITX2表达,能够促进细胞的增殖、迁移及侵袭能力,促进JAR细胞对HEC-1A的黏附作用;以PITX2siRNA下调RL95-2细胞中PITX2表达,能够抑制细胞的增殖、迁移及侵袭能力并可以抑制JAR细胞对HEC-1A的黏附作用。同时检测到上调PITX2后,Wnt/β-catenin信号通路及下游基因Wnt3a、β-catenin、FOXM1、MYC、Cyclin D1等蛋白表达均呈现增高的趋势,相反则降低,表明PITX2可能是通过调节Wnt/β-catenin信号通路进而调节细胞行为。通过调节子宫内膜高低接受态细胞中miR-21-5p的表达,发现miR-21-5p靶向负调节PITX2的表达。
四、结论
1.PITX2在临床分泌期子宫内膜高表达;
2.PITX2在妊娠小鼠着床窗口期子宫内膜高表达,抑制PITX2可抑制胚胎着床率;
3.PITX2在高低接收状态子宫内膜细胞系中存在表达差异;
4.调控子宫内膜细胞PITX2表达可影响子宫内膜增殖、迁移、侵袭能力,并影响Wnt/β-catenin信号通路及下游基因,来调控子宫内膜的容受性建立,进而影响胚胎着床;
5.miR-21-5p对PITX2的表达具有靶向负调控作用。