【研究背景】 糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病最为常见和严重的并发症之一，也是糖尿病主要的致盲原因。DR的发病机制十分复杂，目前认为可能与以下因素有关：1、多元醇—肌醇代谢异常，2、自由基的作用，3、蛋白质的非酶糖基化，4、DG-PKC系统的活化，5、细胞因子的作用，6、局部肾素—血管紧张素系统的作用。蛋白质与葡萄糖等还原糖通过一系列反应形成不可逆的非酶促反应终产物，即晚期糖基化终产物(AGEs)。AGEs不仅仅是糖尿病的并发产物，还可能充当了一种介质作用，在细胞和组织上启动广泛不正常的反应如生长因子不适当地表达、细胞外基质的积聚、血管调节功能障碍以及死亡通道的启动。AGEs能广泛地积存于眼部各组织，作用于其它细胞如视网膜血管内皮细胞、周细胞、视网膜色素上皮细胞、Mǔler细胞等，在DR中起重要的作用。许多研究认为，血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的最重要、最直接的刺激血管生长因子，在新生血管的形成中起重要的作用。新生血管形成过程之一是微血管内皮细胞通过血管基底膜侵润、迁移进入临近细胞外基质(ECM)，侵润过程与特异性细胞外基质酶—基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制物(TIMPs)有关，MMPs活化引起的细胞外基质的降解，被认为是新生血管形成及血管侵润的一个重要生物化学及细胞学调节因素。有研究表明，肾素—血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)与糖尿病视网膜病变(DR)关系极为密切，在糖尿病中，局部＊＊S被激活，与＊R的黄斑水肿、新生血管形成等视网膜的病变有关系，因此进一步研究RAS与DR关系，有助于理解DR的发病机制。同时，有人认为RPE细胞是增殖型糖尿病ODR）增殖膜组成部分之一，RPE细胞在DR中起了不可忽视的作用。因此本实验看重研究了AGES作用于视网膜色素上皮细胞在DR中的作用，以探讨其细胞、分子学机制。 【目的】通过研究 AGES 作用视网膜色素l二皮细胞表达VEGFmRNmRNA，AGES禾 VEGF对色素上皮细胞产生MMPMPS、血管紧张素的影响，进一步弄清AGES在DR发病机制中的作用。 【方法】实验共分四部分。第一部分实验是分离并在体外培养人视网膜色素上皮细胞，并以免疫组织化学方法进行鉴定，制备糖基化终产物及其对照物；第h部分实验以不同浓度的AGES作用yE细胞18h、同一浓度门。ig／ll）AGES作用 RPE组胞不同时I司，用原位杂交法检测RPE细胞中VEGFmRNA的表达并以计算机图像分析仪进行分析；第三部分实验以不同浓IA的 AGES、VEGF分别作用 RPE细胞 24h、28h，同一浓度的 AGES （100吧／11。l）或 VEGF（100llg／1ll）作用RPE细胞不同时间，用酶谱法检测培养液中M七的含量；第四部分实验研究了不同浓度的AGES、VEGF分别作用yE细胞24h、28h，同一浓度的AGES或VEGF作用RPE细胞不同时间，用放免法检测血管紧张素I、11的含量。 【结果】l、第一部分成功分离并培养出了人视网膜色素上皮细胞，成功制备糖基化终产物及其对照物。2、第二部分实验中，不同浓度的 AGES作用 RPE细胞 1811，可见随浓度的升高，VEGFlllRNA的表达逐渐增强：100：g／：IAGES作用 RPE细胞不同时间，作用刀就有VEGFmRNA的表达，并随时间的延长，VEGFInRNA的表达逐渐增强。3、第三部分实验中不同浓度AGEs作用yE细胞24h，可见随浓度的增高，MMP上分泌逐渐增加；100tlg／lllAGES作用 RPE细胞不同时间，可见随时间的延长，WPZ分泌逐渐增加；不同浓度VEGF作用 RPE细胞 2811，可见随浓度的增高，MMPZ 分泌逐渐增加；100ng／mlVEGF作用 RPE细胞不同时间，可见随时间的延长，M－2分泌逐渐增加；各组均未见MMPg的分泌。4、第四部分实验显示，AGEs和 VEGF作用于 RPE ＄胞，各浓度或谷时间组均可见 A 11的分泌，但无显著性差异，各组均未见AI的分泌。 【结论】1、AGES能促使胜E细胞表达 VEGFlllRNRNA，并呈剂量 才 l寸i］依赖性。 2、AGES才 VEGF商促使RPE自胞分泌MMP－2，并呈剂 量和时间依赖性，但个能促使RPE细胞分泌MM卜9。 3、AGEs和 VEGF不能促使 RPE细胞分泌 A 11。 4、AG ES在 DR中作用机制之一，可能是通过促视网膜细 胞表达和分泌 VEGF和 MMPS米起作用的。