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第一部分吸烟对口腔黏膜上皮细胞抗白色念珠菌能力的影响[目的]口腔黏膜上皮细胞作为口腔黏膜的“哨兵”,可以发挥抵抗有害物资侵袭的作用,然而当有害物质侵袭能力大于宿主清除能力时,口腔黏膜上皮细胞被破坏,口腔黏膜局部防御能力下降。香烟烟雾和白色念珠菌是口腔黏膜常见致病物质,香烟烟雾中的毒性物质可通过物理、化学、生物学作用破坏口腔黏膜上皮细胞的完整性,降低组织局部防御能力,白色念珠菌作为口腔内最常见的条件致病菌,当受到外界因素刺激时,如吸烟、抗生素滥用等,可通过多种方式转换成具有致病性的芽管和菌丝态,损伤口腔黏膜上皮细胞。本实验的目的是通过观察白色念珠菌芽管形成率和菌落生成量,探讨CSE对口腔黏膜上皮细胞抵抗白色念珠菌能力的影响。[方法]体外培养Leuk-1细胞,采用四甲基偶氮唑盐（2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT）比色法、实时无标记细胞分析技术（real-time cell assay,RTCA）检测不同浓度（0,4%,8%,16%）和不同时间（3d,5d,7d）CSE以及不同比例（Leuk-1细胞:SC62342 孢子分别为 1:16、1:4、1:1、4:1、16:1）和不同时间（0h,3h,6h,9h,12h,24h）SC62342对Leuk-1细胞增殖性能的影响,以确定适当的CSE和SC62342浓度和时间。本部分实验分为三组,第1组为SC62342组,第2组为Leuk-1+SC62342组,第3组为Leuk-1+CSE+SC62342组,每隔1h观察白色念珠菌芽管形成情况,在共培养24h时观察各组SC62342菌落生成情况。[结果]MTT实验检测结果显示,4%CSE处理Leuk-1细胞3d,Leuk-1细胞:SC62342孢子为4:1时,共培养12h细胞活力均未有明显变化。在后续实验中所用CSE浓度确定为4%,刺激时间为3天。所用SC62342比例为4:1,刺激时间为12小时。三组白色念珠菌培养1h后,孢子态开始长出长短不一的芽管,培养2h后,对比各组芽管形成率发现,Leuk-1+CSE+SC62342组芽管形成率大于Leuk-1+SC62342 组（P＜0.05）,SC62342 组芽管形成率大于 Leuk-1+SC62342 组（P＜0.05）。三组白色念珠菌培养24h后对比菌落图像光密度值发现,Leuk-1+CSE+SC62342 组菌落比 Leuk-1+SC62342 组更密集（P＜0.05）,SC62342组较 Leuk-1+SC62342 组更密集（P＜0.05）。[结论]结果提示,CSE削弱了 Leuk-1细胞的免疫防御能力,促进白色念珠菌芽管和菌落生成。第二部分吸烟和白色念珠菌对口腔黏膜上皮细胞NLRP3炎症小体及其介导的信号通路的影响[目的]口腔黏膜上皮细胞是口腔组织与外环境之间的首道防线,最先受到香烟烟雾所产生的有毒物质的刺激。白色念珠菌是口腔中最常见的机会性真菌,当宿主免疫能力下降时,白色念珠菌从共生菌转化为致病菌,损伤口腔黏膜上皮细胞。有研究表明吸烟和白色念珠菌可通过多种模式识别受体（PRRs）影响上皮细胞防御功能,NLRP3作为重要的胞内模式识别受体,在上皮细胞固有免疫中起重要作用。本实验的目的是研究CSE和SC62342对Leuk-1细胞中NLRP3炎症小体内关键蛋白及下游免疫分子IL-1β和IL-18表达的影响。[方法]本部分实验分为四组,第1组为Leuk-1细胞空白对照组,第2组为Leuk-1+CSE 组,第 3 组为 Leuk-1+SC62342 组,第 4 组为 Leuk-1+CSE+SC62342 组。采用qPCR和免疫荧光法,检测各组NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的表达;收集细胞上清,采用ELISA法检测IL-1β和IL-18的分泌水平。[结果]相比于对照组,Leuk-1细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在CSE处理组中表达水平下降（P＜0.05）,在SC62342组中表达水平上升（P＜0.05）,CSE和 SC62342 共培养组中 NLRP3、caspase-1、IL-1β 和 IL-18 较 SC62342 组下降明显（P＜0.05）。[结论]结果提示,CSE 抑制了 Leuk-1 细胞中 NLRP3、caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表达,削弱了 Leuk-1细胞的免疫防御能力。第三部分NLRP3在吸烟抑制口腔黏膜上皮细胞防御能力中的调控作用[目的]吸烟能够抑制口腔黏膜上皮的固有免疫,是造成许多口腔黏膜疾病的重要原因。前期研究表明,吸烟能够抑制口腔黏膜上皮细胞NLRP3炎症小体关键蛋白的表达,提示吸烟通过抑制NLRP3炎症小体的表达削弱口腔黏膜局部免疫。脂多糖（Lipopolysaccharides,LPS）和三磷酸腺苷（Adenosine-triphosphate triphosphate,ATP）是NLRP3分子的经典激动剂,本实验通过LPS和ATP激活NLRP3分子来探讨NLRP3在CSE抑制口腔黏膜上皮细胞局部防御能力中的调控作用。[方法]本部分实验分为四组,第1组为Leuk-1细胞空白对照组,第2组为CSE处理Leuk-1细胞3d组,第3组Leuk-1细胞应用10 μ g/ml LPS处理5.5h和1mmol/l ATP 处理 0.5h,第 4 组 Leuk-1 细胞先用 10 μ g/ml LPS 处理 5.5h 和 1mmol/l ATP处理0.5h后,再用CSE处理Leuk-1细胞3d。采用qPCR和免疫荧光法,检测各组NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18的表达;收集细胞上清,采用ELISA法检测IL-1β和IL-18的表达。[结果]相比于对照组,Leuk-1细胞中NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18在CSE处理组中表达水平下降（P＜0.05）,经LPS和ATP处理后的CSE组相对于单独CSE组,Leuk-1 细胞中 NLRP3、Caspase-1、IL-1β 和 IL-18 的表达水平上升（P＜0.05）。[结论]NLRP3分子激动剂LPS和ATP的处理逆转了 CSE对NLRP3、caspase-1、IL-1β和IL-18的抑制作用。结果提示,在口腔黏膜上皮细胞,NLRP3炎症小体可能是CSE调控口腔黏膜固有免疫的途径之一。