【摘 要】
：
草甘膦（N-膦酰基甲基甘氨酸）是全球用量最大的灭生性除草剂,通过抑制植物莽草酸代谢途径上游的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPs）,阻断植物芳香族氨基酸的合成,最终导致植物死亡。与其它除草剂相比,草甘膦具有低毒高效、价格低廉等优势。通过转基因技术培育草甘膦抗性作物,在全球已取得了巨大的经济效益和环境效益。然而,国际上广泛应用的抗性基因来源于微生物对草甘膦不敏感的EPSPS基因,其转入植
论文部分内容阅读
草甘膦（N-膦酰基甲基甘氨酸）是全球用量最大的灭生性除草剂,通过抑制植物莽草酸代谢途径上游的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPs）,阻断植物芳香族氨基酸的合成,最终导致植物死亡。与其它除草剂相比,草甘膦具有低毒高效、价格低廉等优势。通过转基因技术培育草甘膦抗性作物,在全球已取得了巨大的经济效益和环境效益。然而,国际上广泛应用的抗性基因来源于微生物对草甘膦不敏感的EPSPS基因,其转入植物可解除草甘膦对芳香族氨基酸合成的抑制,但不能消除草甘膦的残留。而草甘膦在农作物中的残留问题引起越来越多的关注。发掘能够降解草甘膦的基因是解决这一问题的必然选择。为了获得更高草甘膦降解活性和低甘氨酸降解活性的甘氨酸氧化酶,本项目基于分子定向进化策略,对前期获得的甘氨酸氧化酶突变体（B4S7）进行了分子改良,获得了具有潜在应用前景的突变体,为创制新型抗草甘膦作物提供基因资源和深入探讨甘氨酸氧化酶的结构与功能关系提供了重要信息。主要结果如下:（1）采用随机突变及本实验室建立的高通量筛选方法,从11000个突变体中筛选获得三株高活性突变体B5R6,B5R18和B5R26,对草甘膦的km分别为0.052 m M,0.051m M和0.061 m M,其中B5R18活性最高。B5R18对草甘膦的km=0.051m M,kcat=9.740 min-1,kcat/km=189.393 m M-1 min-1,与B4S7相比,其对草甘膦的亲和力和催化效率分别提高了0.95倍和4.23倍;B5R18对甘氨酸的km=59.020 m M,kcat=6.176 min-1,kcat/km=0.105 m M-1 min-1,与B4S7相比其对甘氨酸的亲和力下降了0.17倍,催化效率提高了1.43倍。B5R18的特异性常数(kcat/km,草甘膦与kcat/km,甘氨酸之比)为1811,相比于B4S7提高了1.16倍。（2）基于蛋白质理性设计,对甘氨酸氧化酶第63位氨基酸进行了定点突变,获得F63A,F63G,F63S,F63D,F63R,F63H,F63K七个突变体,研究发现Phe63位点的变化对其活性有明显影响。F63D对草甘膦的亲和力下降了8.32倍,对于甘氨酸则无明显影响。F63A和F63G位对草甘膦的km分别为0.038 m M和0.072 m M,亲和力均产生了较大幅度的提升;而对于甘氨酸的亲和力表现出较大差异,km分别为22.880 m M和88.530 m M。F63H则对草甘膦有较高活性(km=0.103 m M,kcat/km=38.800 m M-1 min-1)的基础上对甘氨酸亲和力（km=266.500 m M）下降了4.29倍,催化效率(kcat/km=0.010 m M-1 min-1)降低了3.53倍。F63H的特异性常数为4084,相比B4S7提高了3.59倍。F63K,F63R,F63S对于两种底物分子的活性没有明显改变。对F63H的酶学性质研究发现,与B4S7相比,其最适温度由60°C变为50°C,最适反应p H由8.5变为8,热稳定性和p H稳定性与B4S7类似;Fe2+和Cu2+对F63H活性具有明显的抑制作用,Ca2+、Mg2+、Mn2+对F63H活性有明显的激活作用。（3）通过定点突变研究不同氨基酸组合突变的协同作用,结果表明Q346R/F63H突变体对草甘膦km=0.035 m M,kcat=3.270 min-1,kcat/km=93.211 m M-1 min-1;对甘氨酸的km=80.300 m M,kcat=2.606 min-1,kcat/km=0.033 m M-1 min-1,Q346R/F63H的特异性常数为2868,相比于B4S7提高了2.43倍。对其酶学性质研究表明,其最适温度由60°C变为50°C,最适反应p H为8.5,热稳定性和p H稳定性与B4S7类似;Fe2+和Cu2+对Q346R/F63H活性具有十分明显的抑制作用,Mn2+对其活性有极强的激活作用。（4）利用生物信息学软件Molecular Operating Environment（MOE）对突变体与不同底物进行分子模拟,D103Y和R238K对于催化活性的影响来自其疏水性以及对催化关键残基Glu55的氢键影响。同样发现Phe63与Gln115的相互作用会影响到Glu55与底物的氢键作用。为进一步研究该酶的结构和功能关系提供了良好的理论基础。
其他文献
在辅助生殖过程中,体外的高氧环境容易使卵母细胞受到氧化损伤。为了获得足够数量的可移植的胚胎,女性或雌性经济动物通常需要进行多次超数排卵,激素药物价格较高,而且大量激素药物容易诱发卵巢过度刺激综合征（OHSS）。双硫仑（Disulfiram,DSF）在临床上用于戒除酒瘾,价格低廉,近年来发现DSF在治疗癌症、炎症和肥胖中也发挥重要作用。在肿瘤细胞中,DSF通过提高活性氧水平,降低谷胱甘肽水平,促进肿
胰岛素是目前治疗糖尿病的主要药物,其给药方式主要为皮下注射。然而长期注射胰岛素会引起多种不良反应,极大降低了患者的顺应性。针对这一问题,学者们对胰岛素的非注射给药途径进行了大量研究,其中口服途径被认为是最理想的给药方式。Sufactin脂肽是芽孢杆菌的天然产物,在生物医药领域具有很好的应用前景,用于胰岛素的口服给药具有较好的降糖效果。在胃酸环境中Surfactin脂肽能与胰岛素结合形成共沉淀,保护
苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）是世界上应用最成功的活菌类生物杀虫剂,对多种农业害虫和线虫具有特异活性。研究发现,Bt作为一种病原菌,除了能够产生主效杀虫因子Cry蛋白毒杀昆虫和线虫外,其基因组上还存在着大量潜在的致病因子参与杀虫,这些致病因子或是通过破坏宿主肠道细胞加速Bt入侵,或是通过抑制宿主免疫防御体系增强Bt的萌发与定殖。研究发现,宿主可以通过天然免疫、
雄性生殖干细胞（male germ stem cell,mGSCs）,又称精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）,是一类存在于曲细精管基底膜上能够自我更新和分化的成体干细胞,并最终分化为精子。m GSCs是研究精子发生、减数分裂的调控和细胞的重编程非常理想的体外模型。X-box binding protein 1（XBP1）基因作为内质网应激通路IRE1α-XB
猪作为一种重要的经济动物,也是器官移植的理想供体,然而其多能干细胞仍未完全成功建系。诱导性多能干细胞（iPSCs）是通过成熟体细胞重编程获得的细胞类型,在生物学特性、分化潜能、基因表达等方面均与胚胎干细胞相似,同时其供体细胞广泛,在生物研究和临床使用上更有优势。然而目前已有的猪诱导性多能干细胞（piPSCs）面临巨大的问题:如其多能性需要依赖外源基因的表达、所建立的piPSCs细胞系对培养条件的变
早期妊娠失败是导致家畜繁殖率低下、阻碍畜牧业发展的重要原因之一。胚胎的成功附植需要发育良好的胚胎与具有良好容受性的子宫内膜之间建立复杂的紧密联系,子宫内膜异常是造成妊娠失败的主要原因。在山羊胚胎附植过程中,子宫内膜主要在E2、P4和IFN-τ等激素的作用下发生形态和功能上的改变,从而为孕体的附植提供最佳环境。尽管有众多细胞因子、转录因子参与调控胚胎附植过程中子宫内膜的功能,但由于其复杂的调控网络,
在真核细胞中,基因组的稳定性依赖于相互协调的多个生理过程,包括DNA复制、DNA损伤修复、细胞周期等。蛋白激酶ATR（ATM-and Rad3-related）是DNA损伤的感应蛋白（sensor）,在DNA复制胁迫反应中起核心作用。在动物中,ATR通过激活CHK1（checkpoint kinase 1）和CDC25（cell division cycle 25）来发挥作用,对胚胎发育是必需的。
随着抗生素的大量滥用,细菌对抗生素的抗性日趋严重。人们把视野逐渐转向抗生素替代品上,噬菌体治疗即是其中最有潜力的一个方向。但是噬菌体与其宿主相互作用的模型多集中于传统模式菌株,限制了人们对噬菌体与其宿主相互作用的认识。另外,近年来,危害作物地下部分的根结线虫和孢囊线虫病,以及蛴螬、地老虎等日益严重,对农业生产造成了巨大危害。目前苏云金芽胞杆菌（Bt）在防治地下病虫害方面取得了突出进展。但是应用实践
PGC7（也称为Dppa3或Stella）是一个无固定结构的小蛋白,长度为150个氨基酸的。因此,我们推测它主要通过与其他蛋白发生相互作用来行使功能。目前关于PGC7功能的研究主要集中在以下几个方面:PGC7在早期胚胎发育中保护母源基因组和母源印迹免受主动去甲基化,促进多能性维持,促进体细胞向诱导多能干细胞（i PSCs）的重编程过程。MASTL（microtubule associated se
玉米小斑病是我国玉米生产上危害最严重的病害之一,由玉米小斑病菌（Cochliobolus heterostrophus）引起,一般导致玉米减产15%-20%,严重时减产50%以上,最严重时颗粒无收。为了揭示玉米小斑病菌的致病机理,本课题利用农杆菌介导的遗传转化法（Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT）构建了玉米小斑病菌野生型菌