论文部分内容阅读
研究背景和目的恶性肿瘤中仅少量肿瘤干细胞在肿瘤的发生和转移过程中发挥关键性的作用,具有克隆形成,自我更新和分化的能力,能够维持肿瘤组织的生长和转移。乏氧可能会导致肿瘤干细胞数量的增加或肿瘤细胞干细胞特性的增强。肿瘤干细胞标志物在肿瘤细胞表面的表达一定程度上与肿瘤细胞的干细胞特性相联系,但目前还存在较大的争论。本研究拟不进行任何分选,通过有限稀释方法以单细胞为起点研究肺癌肿瘤细胞在乏氧条件下是否能获得肿瘤干细胞样特性,本研究通过Western Blot技术及qRT-PCR技术着重探讨CXCR4,Oct-4,SOX2,c-Myc,CD133,CD44,ALDH 1A1在肿瘤正常氧合状态到乏氧到再氧合过程中的变化,其中表达相对稳定,可能与乏氧处理后肿瘤克隆形成、迁移及侵袭能力增强有关。本研究探讨了乏氧对肺癌肿瘤干细胞特性的影响,并进一步探讨了促使这种改变的关键基因,以及通过转染miRNA下调与肿瘤干细胞特性密切相关基因的表达,实现肺癌肿瘤干细胞特性的逆转。第一部分,通过较长时间中度乏氧,增强了肺腺癌H1299及肺鳞癌SK-MES-1干细胞特性,其克隆形成、迁移及侵袭能力均得到增强,并深入研究了多种干细胞特性相关蛋白及mRNA在乏氧环境下的表达以及再氧合后的变化,发现SOX2在乏氧后肿瘤干细胞特性增强过程中持续稳定高表达。第二部分,我们利用miR-145-5p及基因敲除技术对H1299及SK-MES-1细胞系进行了干预,通过体外实验证实了 miR-145-5p抑制H1299及SK-MES-1克隆形成、迁移以及侵袭的作用,并利用裸鼠模型,证实miR-145-5 p抑制H1299及SK-MES-1细胞裸鼠皮下成瘤。第一部分乏氧对肺癌干细胞特性及相关基因表达的影响方法1获取单一细胞起源的克隆群通过有限稀释法,将H1299及SK-MES-1细胞系梯度稀释并接种到96孔板中,直至细胞密度达1个细胞/每孔,显微镜下观察,标记只含有一个细胞的孔,随机对其中的1孔大克隆细胞进行传代,分别标记为H1299及SK-MES-1,培养皿体外扩大培养,用于后续实验。2乏氧上述两种细胞系细胞均分为乏氧-96h、乏氧-48h-常氧-48h、常氧-48h-乏氧-48h以及常氧-96h组,乏氧-96h组在乏氧条件下培养96小时,乏氧-48h-常氧-48h组先乏氧条件下培养48小时,后常氧条件下培养48小时,常氧-48h-乏氧-48 h组先常氧条件下培养48小时,后乏氧条件下培养48小时,常氧-96h组在常氧条件下培养96小时。3肿瘤干细胞特性测定(克隆形成实验,细胞划痕愈合实验以及Transwell细胞侵袭实验)H1299及SK-MES-1细胞株乏氧-96h,乏氧-48h-常氧-48h,常氧-48h-乏氧-48 h和常氧-96h组进行克隆形成实验,细胞划痕愈合实验以及Transwell细胞侵袭实验。4 Western blot及qRT-PCR检测H1299及SK-MES-1细胞株乏氧-96h组、乏氧-48h-常氧-48h组、常氧-48h-乏氧-48h组及乏氧-96h组HIF-1α、ALDH1A1、CD44、CD133、CXCR4、c-Myc、Oct-4及SOX2蛋白质及mRNA表达。结果1乏氧-96h组、乏氧-48h-常氧-48h组及常氧-48h-乏氧-48h组细胞乏氧后肿瘤干细胞特性均较常氧-96h组得到增强H1299及SK-MES-1乏氧-96h组克隆形成数比常氧-96h组分别提高了85.4%和61.7%,而与乏氧-48h-常氧-48h组及常氧-48h-乏氧-48h组差别均无统计学意义。H1299及SK-MES-1乏氧-96h组划痕愈合率比常氧-96h组均提高了24.3%,而与乏氧-48h-常氧-48h组及常氧-48h-乏氧-48h组差别均无统计学意义。H1299及SK-MES-1乏氧-96h组侵袭能力比常氧-96h组分别提高了25%和34.3%,而与乏氧-48h-常氧-48h组及常氧-48h-乏氧-48h组差别均无统计学意义。2乏氧-96h组HIF-1 α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1蛋白表达均较常氧-96h组增强,但恢复至常氧状态下,除SOX2蛋白继续稳定表达外,HIF-1α、CXCR4、Oct4、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1均明显下降。H1299及SK-MES-1 乏氧-96h组HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1蛋白表达较常氧-96h组分别提高了3.55和3.82倍,3.63和3.75倍,4.00和3.81 倍,3.26和3.74倍,4.78和3.78倍,4.38和3.77倍,4.20和3.80倍,2.68和3.68倍;H1299及SK-MES-1 乏氧-48h-常氧-48h组HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1 蛋白表达分别为常氧-48h-乏氧-48h组的24%和27%,34%和32%,25%和34%,87%和1111%,1 8%和20%,34%和34%,20%和23%,30%和27%。细胞乏氧后,SOX 2蛋白持续稳定表达。3乏氧-96h组HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1 mRNA表达均较常氧-96h组增强,但乏氧后恢复至常氧状态下,除SOX2 mRNA继续稳定表达外,HIF-1 α、CXCR4、Oct4、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1均明显下降H1299及SK-MES-1 乏氧-96h组HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1 mRNA表达较常氧-96h组分别提高5.77和8.94倍、5.59和7.24倍、8.4 8.66倍、8.43和9.71 倍、5.48和3.9倍、4.18和3.4倍、6.28和6.42倍,5.07和5.14倍;H1299及SK-MES-1 乏氧-48h-常氧-48h组HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1mRNA表达分别为常氧-48h-乏氧-48h组 13%和 17%,14%和28%,13%和20%,85%和86%,9%和 12%,21%和 19%,12%和20%,16%和 16%,细胞乏氧后,SOX2 mRN A持续稳定表达。结论1乏氧后即使恢复常氧状态,H1299及SK-MES-1细胞克隆形成、迁移及侵袭能力均得到明显增强,肿瘤干细胞特性增强持续存在。2 Western Blot及qRT-PCR均证实乏氧后HIF-1α、CXCR4、Oct4、SOX2、c-Myc、CD133、CD44及ALDH1A1表达上调,但乏氧结束后恢复至常氧状态,上述基因除SOX2外均出现明显下降,SOX2乏氧后形成稳定表达。3 SOX2可能为驱动肿瘤细胞干细胞特性增强的功能基因。第二部分miR-145-5p抑制肺癌细胞SOX2表达的体外和体内研究方法在体外实验中,使用miR-145-5p mimics和空白载体分别转染肺癌细胞系H 1299和SK-MES-1,分别为实验组和对照组,两组细胞进行克隆形成实验、细胞划痕愈合实验以及Transwell细胞侵袭实验;Western blot和qRT-PCR检测转染后两组SOX2蛋白及mRNA表达。H1299和SK-MES-1实验组和对照组细胞分别接种于6对裸鼠,两个细胞系各两组,共计24只,观察对比实验组和对照组细胞皮下成瘤能力。使用siRNA技术将SOX2基因敲除。检测对比siRNA组和siRNA对照组S OX2基因mRNA和蛋白的表达情况,检测转染效率,确定SOX2被敲除。将SOX2基因敲除的siRNA组细胞,分别转染miR-145-5p mimics及lipofe ctamine RNAiMAX作用,分为siRNA + miRNA组以及siRNA + lipo-max组,与未经转染的普通对照组细胞对比SOX2 mRNA及蛋白的表达,进一步确定S OX2基因表达被抑制。通过克隆形成实验、细胞划痕愈合实验以及Transwell细胞侵袭实验检测对比siRNA + miRNA组与siRNA + lipo-max组肿瘤干细胞特性。进一步明确mi R-145-5p是通过抑制SOX2而非其他通路抑制肿瘤干细胞特性的作用。该部分实验基本思路为,转染miR-145-5p mimics证明miR-145-5p能购抑制肿瘤干细胞特性,抑制SOX2表达。敲除SOX2基因,再次转染miR-145-5p,实验组与空白对照比较肿瘤干细胞特性。若肿瘤干细胞特性无差别,则可以充分说明miR-145-5p通过SOX2而非其他通路发挥作用。结果1 miR-145-5p抑制H1299和SK-MES-1细胞克隆形成能力和皮下成瘤能力H1299和SK-MES-1细胞实验组克隆形成能力分别为对照组的66.7%和68.3%,皮下注射肿瘤细胞后的第25天,H1299和SK-MES-1实验组的肿瘤平均重量分别为对照组肿瘤重量的28%和24%。2 miR-145-5p抑制H1299和SK-MES-1细胞的迁移能力、侵袭能力H1299和SK-MES-1细胞实验组划痕愈合率分别对照组的79%和68%;实验组侵袭细胞数分别为对照组的56%和70%。3 miR-145-5p抑制SOX2蛋白和mRNA的表达H1299和SK-MES-1细胞实验组SOX2蛋白表达为对照组的68%和78%;实验组SOX2 mRNA表达分别为对照组71%和73%。4 SOX2基因敲除后,miR-145-5p不能抑制肿瘤干细胞特性H1299和SK-MES-1细胞SOX2基因敲除后,转染miR-145-5p的siRNA +miRNA组与转染空白载体的siRNA + lipo-max组细胞,在克隆形成能力、迁移和侵袭能力方面无差别。结论1体外实验中,miR-145-5p抑制了H1299和SK-MES-1细胞的克隆形成、迁移和侵袭能力。2体内实验中,miR-145-5p对H1299和SK-MES-1细胞在裸鼠皮下成瘤能力具有明显的抑制作用。3 miR-145-5p可以通过下调SOX2蛋白及mRNA表达,减弱H1299和SK-MES-1干细胞特性。4 SOX2基因驱动了H1299和SK-MES-1干细胞特性的增强,是潜在的临床治疗的靶点和潜在的肿瘤干细胞的表面标记物,以期应用至肿瘤干细胞的分选和鉴别中。