HDAC抑制剂调控激活血小板诱导的NETs形成的实验性研究

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目的:NETs过度形成在脓毒症、缺血再灌注损伤和脑卒中等急危重症病理生理过程中的作用已经被证实,但由于体内NETs形成失调的机制十分复杂,目前尚无有效手段对其进行干预。近年来,大量研究发现血小板激活失调是体内NETs过度形成的重要诱导因素。本课题组前期研究发现HDAC抑制剂可以削弱脓毒症休克小鼠血清NETs标记物的升高,另有研究发现HDAC参与血小板激活。因此,本课题尝试建立激活血小板诱导NETs形成的技术体系,为进一步揭示血小板激活和NETs形成的内在联系提供技术支持,同时评估HDAC抑制剂对激活血小板分泌和NETs诱导能力的影响,探索HDAC抑制剂器官功能保护作用的机制。研究方法:采集健康人静脉血,分离新鲜血小板和中性粒细胞。分离所得血小板在体外用血小板激活剂预处理,而后将预处理血小板和中性粒细胞共培养以诱导NETs形成。在培养基中加入细胞外核酸染料Sytox green,于培养期间持续重复测量悬液中Sytox green的荧光强度。用测得数据建立荧光强度-时间动力曲线以对NETs形成进行动态监测和定量分析。利用活细胞显像和免疫荧光技术对NETs形成进行定性分析。通过比较荧光强度随时间的变化趋势和荧光强度增加量,评估各种诱导物NETs诱导能力的差异。除此之外,我们也分离预处理血小板悬液的上清并用ELISA检测PF4浓度反映分泌功能。通过比较各种预处理血小板悬液上清PF4浓度,确定各种处理对血小板分泌功能的影响。结果:PMA刺激后的中性粒细胞DNA释放规律发生改变,其DNA释放增加,活细胞显像观察到DNA构成的网状结构形成,免疫荧光见NE附着在网状结构上,表明分离所得中性粒细胞可被激活进而产生NETs。和预激活血小板共培养的中性粒细胞DNA释放规律发生改变,DNA释放增加,活细胞显像观察到DNA构成的网状结构形成,且免疫荧光可见NE附着在网状结构上,表明预激活血小板能诱导NETs形成。中性粒细胞和经HDAC抑制剂处理的预激活血小板共培养也有上述改变,提示经HDAC抑制剂处理的预激活血小板仍能诱导NETs形成。与未经处理的预激活血小板相比,HDAC抑制剂处理的预激活血小板诱导DNA释放的规律不同、数量减少,表明HDAC抑制剂可以削弱预激活血小板诱导NETs的能力。用血小板激活剂处理后的血小板悬液上清PF4浓度增加,并且高于HDAC抑制剂处理的预激活血小板悬液上清PF4浓度,而后者上清PF4浓度高于未加刺激剂的血小板悬液上清PF4浓度,表明HDAC抑制剂不能完全阻断激活血小板PF4的分泌,但具有一定削弱作用。结论:HDAC抑制剂可以削弱激活血小板的NETs诱导能力,其部分机制可能是下调激活血小板的分泌功能。
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