本实验旨在观察褪黑素刺激对内蒙古绒山羊毛囊干细胞来源的外泌体的形态、粒径、蛋白表达量及分泌量的影响,并探讨了外泌体对于毛囊相关受体细胞的影响。1.探寻褪黑素刺激毛囊干细胞分泌外泌体的最适浓度和作用时间。设置0、100、300、500、700 pg/mL的褪黑素浓度,作用于毛囊干细胞,观测其增殖,提取细胞上清的外泌体。结果显示,500 pg/mL浓度的褪黑素是毛囊干细胞的最适增殖浓度,且作用3d后提取细胞上清的外泌体最佳。2.外泌体的提取与鉴定,观察最适褪黑素浓度处理下的形态、大小、蛋白表达量及分泌量。设立0 pg/mL、500 pg/mL褪黑素、500 pg/mL褪黑素+500 pg/mL Luzindole(MTI+MT2 受体阻断)、500 pg/mL 褪黑素+500 pg/mL 4-P-PDOT(MT2受体阻断),分别刺激毛囊干细胞,提取各组外泌体。透射电子显微镜观察外泌体的形态、大小,BCA蛋白定量,Western blot检测蛋白表达量。结果显示,刺激组与未刺激组外泌体形态、大小差别不大,均表达外泌体表面标记物HSP70、CD9、CD81,蛋白定量结果显示褪黑素刺激毛囊干细胞后,外泌体分泌量增多。3.探究各组外泌体对毛囊相关受体细胞(毛囊干细胞和毛乳头细胞)的影响。将各组外泌体按浓度梯度作用于毛囊干细胞和毛乳头细胞,MTT法检测受体细胞增殖情况,Transwell小室检测受体细胞迁移情况。分别提取0d、1d、3d、5d、7d、14d和21d受体细胞的RNA,以cDNA为模板,q-PCR检测受体细胞毛囊发育相关基因β1-整合素、SOX9、FGF5、β-caintein、KAP7、KAP8的表达。结果显示,外泌体促进毛囊干细胞和毛乳头细胞的增殖、迁移和发育相关基因的表达,可以促进毛囊干细胞向毛囊细胞分化。褪黑素刺激后的外泌体促进效果更明显,且呈伴浓度梯度增大而增加。