miRNA是一类长度为19-24个核苷酸的单链非编码小RNA，它能通过直接与靶mRNA3’非翻译区（3’-UTR）的结合发挥调节作用。很多研究表明miRNA的异常表达和肿瘤的发育有关。miR-31的异常表达发生在包括结肠癌在内的各种肿瘤中。大量的研究表明miRNA可以对多种细胞生物学行为发挥调节作用，例如：个体发育、细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等。越来越多的证据证实miRNA在肿瘤的致癌作用和肿瘤的发展中起着至关重要的作用，人们发现在各种肿瘤中多种miRNA的表达是上调或者下调的。在各种肿瘤的发生中，miRNA一部分起着肿瘤抑制因子的作用，一部分起着促癌因子的作用。为了进一步认识miRNA的分子机制，研究者们将研究内容扩展到对miRNA下游的靶基因的研究。由于一个miRNA分子可能会有很多靶基因，一个靶基因也可能受到多个miRNA的调控，在肿瘤miRNA的表达谱研究基础上研究表达异常的单个miRNA的作用和分子机制是很重要的，也是肿瘤miRNA分子治疗的研究关键。miRNA-31在恶性肿瘤中起着重要的作用，其表达异常在很多肿瘤中得到证实。例如，在头颈部癌症，肝细胞癌，肺癌和结肠癌表达上调。很多报道揭示miR-31与癌症转移能力相互关联，抑制miR-31有助于乳腺癌的转移。Laurila等人发现抑制和升高miR-31的表达都能导致胰腺癌细胞的迁移和侵袭能力。据报道，在结肠癌，miR-31表达显著升高，其表达水平在结肠癌的各个阶段表达水平不同，miR-31与结肠癌的侵袭和转移有关，抑制miR-31影响结肠癌细胞的迁移和侵袭。miR-31在结肠癌的早期阶段也有表达异常，抑制miR-31的表达能够增加5-FU的敏感性。虽然miR-31被证实与结肠癌有关，但是它的发生机制尚不明朗。RhoBTB蛋白属于小GTP酶的Rho家族的一种亚家族。RhoBTB亚家族包含三个成员，RhoBTB1，RhoBTB2和RhoBTB3。RhoBTB2是RhoBTB亚家族第一个被发现的肿瘤抑制因子，首先在乳腺癌中被报道出来。RhoBTB的转录的缺乏导致生长的抑制。研究表明RhoBTB2杂合性缺失的高发生率集中发生在胃癌和膀胱癌中。与RhoBTB2相似，近来发现，RhoBTB1在头颈肿瘤中是肿瘤抑制因子。本课题首先采用实时荧光定量PCR技术检测miR-31在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达。然后通过建立体外细胞模型来研究miR-31对结肠癌细胞多种生物学行为的影响，并利用预测软件寻找miR-31的下游靶基因，阐明其在结肠癌发挥作用的分子机理。本课题的研究成果将加深我们对结肠癌发病机制的了解，为结肠癌的早期诊断和治疗提供新线索，同时可以为与此相关的新药开发提供重要的分子靶点。1材料与方法1.1肿瘤组织样本收集和细胞培养结肠癌组织和癌旁正常组织从17例结肠癌患者中收集。SW480细胞株和HT29细胞株HT29是从美国模式培养物集存库（ATCC），并在指示的条件下培养。1.2RNA提取和实时荧光定量PCR用TRIzol试剂从细胞和肿瘤组织中提取总RNA。我们用茎环RT-PCR方法进行miR-31的检测，用U6作为内参。RhoBTB1mRNA的检测使用M-MLA反转录系统将RNA逆转录成cDNA。qRT-PCR使用SYBR Green qPCR Master Mix在ABI7300上完成。GAPDH作为内参。1.3荧光素酶基因报告分析在转染之前24小时将HT-29细胞接种到24孔板上，然后海肾荧光素酶、包含有miR-31序列或对照的荧光素酶报告质粒和野生型或突变型靶基因3’UTR共同转染细胞，使用Lipofectamine2000转染，转染之后48小时，用双荧光色素酶基因报告系统测量荧光素酶的活性。1.4免疫蛋白印迹分析细胞转染之后收集细胞，用细胞裂解液将细胞裂解。对一定量的蛋白样本用SDS-PAGE，用PVDF转膜，5%脱脂牛奶封闭30分钟以后，RhoBTB1抗体室温孵育2小时，接着用辣根过氧化酶连接的二抗室温孵育1小时，ECL法检测。β-actin作为内参。1.5免疫组织化学和原位杂交：肿瘤组织和癌旁正常组织样本用石蜡包埋并切片。然后用RhoBTB1抗体孵育，生物素过氧化酶系统检测，并使用二氨基联苯胺作为色原。原位杂交法，使用地高辛(DIG)标记的锁核酸（LNA）miR-31探针。通过与辣根过氧化物酶结合的抗地高辛抗体共同孵育，检测原位杂交信号。1.6MTT在制造商的指示下使用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide进行细胞增殖实验的检测。HT-29细胞在转染之前接种到96孔板上，将各孔中加入MTT溶液，细胞在培养箱中孵育4小时。弃液体，100μl DMSO加入各孔，摇动15分钟后，检测在490nm的吸光度。1.7软琼脂克隆形成实验：含有20%胎牛血清的预热的2×RPMI-1640培养液1ml和1.2%琼脂溶液1ml混合，然后转移到3cm平皿中，4℃孵育30min让底部的琼脂层凝固。接下来混合50℃0.5ml0.6%琼脂和等量的2×medium并储存于40℃水浴中，然后加入1×103细胞，并快速混匀，倒在琼脂层底部。细胞在培养箱中孵育2周。显微镜下观察细胞克隆，克隆大于50个细胞被计数。1.8数据分析数据以平均值加减标准差计数。两组之间的比较选用t检验，其他选用卡方检验。2结果2.1miR-31在人结肠癌组织及细胞系中表达上调。我们用实时荧光定量PCR方法检测miR-31的表达，与正常结肠组织相比，miR-31的在肿瘤组织中的表达显著升高。原位杂交实验进一步证实在结肠癌组织中发现miR-31表达增高。qRT-PCR实验在与正常结肠组织相比，HT-29和SW480细胞系中miR-31的表达均升高。2.2抑制miR-31的表达能够影响结肠癌细胞的活力和克隆增殖。为了检查miR-31在结肠癌发展中的作用，我们应用锁核酸反义miR-31抑制HT-29细胞中的miR-31的表达。MTT实验证实，miR-31的抑制能够有效的降低结肠癌细胞的活性。这表示miR-31的上调和结肠癌的发生有关。软琼脂实验结果显示，在miR-31被抑制后，软琼脂中的细胞克隆形成也受到了抑制。2.3RhoBTB1是miR-31的靶蛋白。通过使用在线miRNA靶基因预测数据库，我们假定RhoBTB1是miR-31的靶蛋白。首先我们构建了荧光素酶报告质粒，包含有RhoBTB13’UTR序列（野生型-RhoBTB1）或删除了假定的miR-31结合位点的序列（突变型-RhoBTB1）与miR-31拟似物共同转染的细胞的荧光素酶活性与对照miRNA转染的细胞相比明显降低，但是转染突变型RhoBTB1的质粒的细胞的荧光素酶活性实验组和对照组相比没有显著差异。2.4miR-31能够下调RhoBTB1在结肠癌细胞HT29中的表达。RhoBTB1在结肠癌组织中的表达是下调的。与转染对照RNA的HT-29细胞相比，转染miR-31拟似物的HT-29细胞中RhoBTB1mRNA的表达水平显著下降。WB实验结果显示在miR-31拟似物转染之后，HT29细胞中RhoBTB1的蛋白表达水平也是下降的。我们采取免疫组化及免疫蛋白印迹的实验方法检测RhoBTB1在结肠癌组织中的表达。与正常组织相比，RhoBTB1在结肠癌组织中的表达明显减少。2.5RhoBTB的表达抑制与miR-31促肿瘤生长的作用有关。为了进一步证实miR-31对结肠肿瘤发展的诱导作用通过RhoBTB1调节。我们应用RNAi的方法在HT-29细胞中降低RhoBTB1的表达。MTT实验证明RhoBTB1的表达下降能够诱导HT-29细胞的增殖。软琼脂克隆形成实验证明RhoBTB1的抑制能够促进结肠癌细胞克隆的生长。3结论3.1miR-31与结肠癌的肿瘤生长有关。3.2RhoBTB1是miR-31下游的一个靶基因。3.3miR-31促进肿瘤生长机制与抑制RhoBTB1的表达有关。