【摘 要】
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背景与目的:人多能干细胞诱导提供了几乎不限量的心肌细胞用于疾病建模、药物筛选和细胞治疗等,但目前使用的心肌细胞分化方法所产生的细胞包含多种异质细胞群,如心肌工作细胞（心室肌细胞,心房肌细胞）、起搏细胞以及其他种类细胞。由于缺乏明确的心肌工作细胞表面标志物,hPSC-CMs只能根据心室、心房细胞所具有电生理特性的不同,借助单细胞膜片钳技术进行亚型分辨。本课题旨在构建一种荧光报告系统,可以在体外通过流
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背景与目的:人多能干细胞诱导提供了几乎不限量的心肌细胞用于疾病建模、药物筛选和细胞治疗等,但目前使用的心肌细胞分化方法所产生的细胞包含多种异质细胞群,如心肌工作细胞（心室肌细胞,心房肌细胞）、起搏细胞以及其他种类细胞。由于缺乏明确的心肌工作细胞表面标志物,hPSC-CMs只能根据心室、心房细胞所具有电生理特性的不同,借助单细胞膜片钳技术进行亚型分辨。本课题旨在构建一种荧光报告系统,可以在体外通过流式分选富集到高纯度的各亚型心肌工作细胞。方法:本课题采用CRISPR/Cas9基因编辑方法将eGFP荧光标记直接插入到hPSCs的心室特异性基因MYL2以及心房特异性基因MYL7后,建立了一种新的荧光报告系统用于区分心室肌细胞与心房肌细胞。在荧光基因正确插入的报告细胞系正常诱导分化为心肌细胞后,eGFP荧光基团与特异基因表达蛋白MLC-2v、MLC-2a以单独的形式共表达。基于荧光基团进行流式分选后,我们能够从hPSC-CMs中富集到高纯度的各亚型心肌工作细胞。结果:本课题成功将eGFP荧光标记导入细胞心室特异性基因MYL2以及心房特异性基因MYL7中,构建了可稳定传代且仍具有干细胞特性的报告细胞系。将报告细胞系成功分化为心肌细胞后,eGFP荧光基团与MLC-2v、MLC-2a以单独的形式共表达,从而可以通过流式分选得到各亚型心肌细胞。经膜片钳验证发现,其动作电位特征均符合各亚型电生理特征。结论:心肌工作细胞荧光报告系统为区分出hPSC-CMs的各亚型心肌细胞提供了一种新颖有效的方法,将各报告细胞系诱导为心肌细胞,随后利用流式分选技术即可方便、准确地分离出均质的人心室肌细胞与心房肌细胞。
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