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一、背景与目的药物代谢酶(Drug metaolizing enzymes,DMEs)和外排转运蛋白(Efflux transporters,ETs)对药物体内的吸收和处置过程有着不可或缺的作用。II相药物代谢酶包括葡萄糖醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases,UGTs)和磺酸化转移酶(Sulfotransferases,SULTs)等是肝脏和小肠的主要代谢酶之一,广泛参与各种药物的代谢过程。外排转运蛋白主要包括P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein,BCRP)、多药耐药蛋白 2(Multidrug resistance protein 2,MRP2)和多药耐药蛋白 1(Multidrug resistance protein 1,MRP1)等,它们主要介导药物体内的外排过程。因此,研究药物代谢酶和外排转运蛋白对药物体内药动学特征和药效作用的调控机制具有重要意义。毛蕊异黄酮(Calycosin,C)是一种具有多种药理活性的异黄酮化合物,是黄芪中的主要活性成分之一,具有抗氧化作用、心血管保护作用、肝脏保护作用和抗肿瘤作用等[1-4]。课题组前期已研究黄芪水煎液和毛蕊异黄酮-7-O-β-葡萄糖苷(Calycosin-7-O-β-glucoside,CG)在体内的药代动力学特征和肠道处置机制,结果表明CG大部分水解为毛蕊异黄酮后参与体内的处置过程。然而目前对毛蕊异黄酮的药代动力学特征及其肝肠处置研究尚无报导。因此本课题采用FVB小鼠和外排转运蛋白基因敲除小鼠为受试对象,研究磺酸化转移酶和外排转运蛋白在毛蕊异黄酮的药代动力学特征和肠道处置中的作用及调控机制,为黄芪的临床用药和日后新药的开发提供理论依据。二、实验方法1.采用高分辨质谱和核磁共振氢谱为分析手段,鉴定毛蕊异黄酮的磺酸化代谢产物,并通过液质联用仪(UHPLC-MS/MS)建立同时检测毛蕊异黄酮及其磺酸化和葡萄糖醛酸化代谢产物的质谱方法。2.以FVB、Bcrp1(-/-)、Mrp2(-/-)和Mrp1(-/-)小鼠为受试动物,通过药代动力学模型和在体肠灌流模型,分别考察外排转运蛋白对毛蕊异黄酮的药代动力学特征和肠道处置过程的影响。此外,采用小鼠肝肠S9和人源化sULTs考察毛蕊异黄酮的磺酸化代谢特征。3.采用Caco-2、MDCK Ⅱ/WT和MDCK Ⅱ/BCRP细胞模型,进一步确证BCRP对毛蕊异黄酮磺酸化代谢产物的外排作用。三、实验结果1.毛蕊异黄酮的磺酸化代谢产物的鉴定通过高分辨质谱和核磁共振氢谱信息鉴定了毛蕊异黄酮的磺酸化代谢产物的结构,毛蕊异黄酮磺酸化代谢的取代位置为3’位羟基,即该化合物为毛蕊异黄酮-3’-磺酸酯(calycosin-3’-sulfate,C-3’-S)。2.毛蕊异黄酮在小鼠体内的药代动力学研究口服给药20 mg/kg毛蕊异黄酮后,在体内吸收迅速且消除较快。C在FVB、Bcrp1(-/-)和Mrp1(-/-)小鼠体内均5 min内迅速达峰。在小鼠血浆中检测到C、毛蕊异黄酮-3’-葡萄糖醛酸苷(calycosin-3’-glucuronide,C-3’-G)和 C-3’-S,其中C-3’-G 的血药浓度最高,C-3’-S次之,原型C最低。相比于FVB小鼠,C-3’-G在Bcrp1(-/-)小鼠体内的最大血药浓度(Cmax)、药时曲线下面积(AUC0-24h)和半衰期(T1/2)分别显著性增加了1倍、2.9倍和1.4倍(p<0.01);C-3’-S在Bcrp1(-/-)小鼠体内的Cmax、AUC0-24h分别显著性增加了 15.8倍、41.3倍和1.8倍(p<0.01);原型C在Bcrp1(-/-)小鼠体内的Cmax,ax和AUC0-24h显著性升高了 6倍和3倍(p<0.05)。Mrp1(-/-)小鼠对C、C-3’-G和C-3’-S的药代动力学参数无显著性差异。3.毛蕊异黄酮的肠道吸收和处置毛蕊异黄酮在小肠的吸收量显著高于其在结肠的吸收量(p<0.01)。在灌流液中,小肠段对C-3’-S和C-3’-G的外排量均显著性的高于其在结肠段的外排量(p<0.01),C-3’-S在两肠段的外排量要高于C-3’-G的外排量。Bcrp1(-/-)小鼠对C-3’-S肠道的外排量显著性低于野生型FVB小鼠,其中C-3’-S在小肠段显著性降低了 82.3-91.3%,在结肠段显著性降低了 97.6-98.2%(p<0.01);Mrp2(-/-)和Mrp1(-/-)小鼠对C-3’-S肠道的外排量与FVB小鼠相比均无明显差异。对于C-3’-G而言,Mrp1(-/-)小鼠在小肠和结肠段对C-3’-G的排泄量要高于FVB小鼠;Bcrp1(-/-)小鼠对C-3’-G肠道的外排量无明显差异。Mrp2(-/-)和Bcrp1(-/-)小鼠对C-3’-S的胆汁排泄与FVB小鼠相比要显著性的降低(p<0.01)。体外孵育实验结果表明SULTA1、SULT1B1和SULT1E1是毛蕊异黄酮磺酸化代谢生成C-3’-S的主要代谢酶亚型。4种小鼠的小肠S9片段均对毛蕊异黄酮的磺酸化速率最大,其次为结肠和肝。毛蕊异黄酮在小鼠肝和结肠S9片段中的酶代动力学类型为底物抑制,小肠S9片段为米氏方程。4.外排转运蛋白对毛蕊异黄酮代谢物的处置作用毛蕊异黄酮主要以被动扩散形式进入细胞并代谢生成C-3’-S。在双向转运实验中,加入BCRP抑制剂Ko143后,C-3’-S在A面的外排量、外排速率和清除率分别显著降低了 44.7-65.7%、54.2-66.4%和 33.9-78.2%(p<0.01);并且在 Fmet 值未改变下,C-3’-S的胞内浓度显著性的增加了 48.5-81.0%(p<0.01)。Western blot 结果显示 MDCK II/WT和 MDCK Ⅱ/BCRP 细胞均表达有 SULT1A1、SULT1B1和BCRP,且MDCK II/BCRP细胞中BCRP的表达水平显著高于其在MDCKⅡ/WT细胞的表达水平。在双向转运实验中,相比于MDCK Ⅱ/WT细胞,MDCKⅡ/BCRP细胞中C-3’-S在A面的外排量和外排速率分别显著性升高了 10.5-13倍和11.3-15.6倍(p<0.01)。在MDCK Ⅱ/BCRP 细胞的 A面加入 Ko143 后,C-3’-S 的外排量、外排速率和清除率分别显著降低了 39.7-88.1%,51.0-87.9%和89.1-97.2%倍(p<0.01);虽然Ko143降低了Fmet值,但细胞内的(C-3’-S仍显著性的增加了3.2-6.4倍。四、结论1.毛蕊异黄酮的体内处置过程主要受BCRP的调控作用,BCRP对C-3’-S的外排有重要作用,MRP2和BCRP对C-3’-G的胆汁排泄有重要作用。2.毛蕊异黄酮主要以被动扩散形式在小肠迅速吸收,并在小肠部位发生广泛的葡萄糖醛酸化和磺酸化代谢,主要代谢产物有C-3’-G和C-3’-S,其中毛蕊异黄酮磺酸化代谢主要由SULTA1和SULT1B1介导,SULT1E1次之。