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由稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻上危害最为严重的真菌病害之一，每年给水稻生产造成巨大经济损失。在前期研究中表明，稻瘟菌MAP（MitochondrionATP-dependent Protease）蛋白酶（MoMAP）可能参与侵染性菌丝的扩展过程，调控稻瘟菌的致病性。由于在调控细胞周期与分化、逆境应答和呼吸代谢等生理生化过程中的重要作用，MAP蛋白酶被受到广泛的关注和研究，被誉为“明星蛋白”。但是作为重要的植物病原真菌，稻瘟菌中的MAP蛋白酶以及其在致病过程中的作用还没有报道。为明确MoMAP及其互作蛋白在稻瘟菌侵染和致病过程中的作用，我们将通过以下几个方面的研究来建立MoMAP的致病调控网络，明确稻瘟菌侵染性菌丝扩展的分子机制以及寄主—病原菌的致病过程，为深入研究稻瘟菌的致病机制提供理论基础，同时为稻瘟病的有效防治提供科学依据。1．MoMAP亲和纯化。通过RT-PCR扩增获得MoMAP基因的完整开放阅读框，ORF编码1120个氨基酸，分子量为122kDa，其大小为3360bp，等电点为5.45。通过序列以及同源性比对分析，该蛋白酶为AAA+蛋白酶家族，在真核生物、原核生物以及哺乳动物细胞中高度保守。构建完成原核表达载体，经IPTG诱导后，MoMAP融合蛋白在大肠杆菌中高度表达，通过Ni-NTAAgarose亲和层析，获得纯化的MoMAP融合蛋白。2．MoMAP互作蛋白的筛选。利用His Pull-down以及串联亲和纯化技术筛选MoMAP互作蛋白，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和Maldi-TOF MS鉴定相结合的方法，筛选得到enoyl-CoAhydratase、ceramide glucosyltransferase、leucyl-tRNAsynthetase等18个感兴趣的可能的互作蛋白。此外，这两种方法筛选到了同一种互作蛋白enoyl-CoAhydratase。3．酵母双杂交验证MoMAP与互作蛋白的互作关系。通过酵母双杂交系统，对筛选得到的互作蛋白作进一步验证。验证结果表明enoyl-CoAhydratase、C3HCzinc finger domain-containing protein、Zinc finger,C2H2type等11个蛋白与MoMAP具有互作关系。总之，本次研究我们纯化了稻瘟菌中依赖于ATP的蛋白酶MoMAP，并通过两种Pull-down技术筛选了MoMAP的互作蛋白，利用酵母双杂交系统对互作关系作进一步验证。结果表明：MoMAP与互作蛋白组成复杂的调控网络，在脂肪酸代谢、金属转运、转录因子调控、蛋白质合成、磺酸代谢、离子通道以及细胞死亡等多种方面起着重要的作用。MoMAP与互作蛋白通过诸多生物学途径，共同介导稻瘟菌侵染性菌丝的扩展以及致病性的调控。