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MicroRNAs(miRNAs)对骨骼肌发育过程中起着关键的作用。之前的研究发现miR-128在骨骼肌中高表达,但其对骨骼肌发育的调节机制尚不明确。本研究通过生物信息学预测分析,发现miRNA-128可能结合到肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)mRNA的编码区(Coding DomainSequence,CDS)区,进而调控骨骼肌细胞的增殖与分化。我们利用C2C12成肌细胞为模型,分别将miRNA-128前体、抑制剂、mimics与阴性对照(NC)转染到C2C12细胞中,并运用5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,EdU)细胞增殖检测、流式细胞术、定量PCR、免疫荧光和蛋白印迹等分子生物学技术,探讨了 miRNA-128差异表达对MSTN的表达和对成肌细胞增殖与分化的影响;同时检测小鼠体内miRNA-128与MSTN在体内的表达模式,得到以下结果:1.miRNA Stem-loop RT-PCR定量检测结果显示,miRNA-128的表达量随着小鼠日龄的增加以及C2C12成肌细胞的分化而显著升高。提示miRNA-128可能参与调控骨骼肌细胞的发育过程。2.在C2C12细胞中过表达miRNA-128降低了 MSTN蛋白的表达水平;转染miRNA-128的抑制剂升高了 MSTN的蛋白水平,但是miRNA-128差异表达对MSTN的mRNA水平没有影响。这些结果表明miRNA-128差异表达影响了 MSTN蛋白的表达。3.构建包含miRNA-128与MSTN结合的种子序列及其突变的质粒,将重组质粒与miRNA-128的mimics共同转染到C2C12细胞与HEK293细胞中;用双荧光报告检测试剂盒检测细胞荧光素酶活性,结果发现:与转染带有突变序列质粒的细胞相比,miRNA-128 降低了 MSTN重组质粒的荧光素酶活性,提示MSTN是miRNA-128的靶基因。4.荧光定量PCR检测发现:当miRNA-128在C2C12成肌细胞中过表达后,细胞中成肌标记基因Myf5、MyoG、Pax3/7的表达量显著降低;当C2C12成肌细胞中miRNA-128表达受到抑制时,细胞中成肌标记基因MyoG、Myf5、Pax3/7的表达量显著升高。结果暗示miRNA-128差异表达会影响C2C12成肌细胞的增殖与分化。5.通过EdU细胞增殖试验检测发现:当miRNA-128在C2C12成肌细胞中表达时,显著降低了 C2C12成肌细胞的增殖;流式细胞仪分析发现:G1期细胞数目显著增多,说明miRNA-128过表达能够将成肌的细胞周期阻滞在G1期,从而抑制成肌细胞增殖。另一方面,当miRNA-128的表达受到抑制时,则促进了 C2C12成肌细胞增殖。6.当miRNA-128在C2C12成肌细胞中过表达时诱导其分化,通过免疫荧光检测发现:C2C12成肌细胞中成肌标记基因肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达量显著升高;荧光定量PCR检测发现:肌细胞生成素(myogenin,MyoG)与MyHC基因的mRNA水平增加了;Western blot结果显示:MyHC蛋白的表达量显著升高。结果表明:miRNA-128过表达能够促进C2C12成肌细胞分化,而当miRNA-128的表达受到抑制时,成肌标记基因MyHC、MyoG的表达降低了,说明成肌细胞分化受到抑制。综上所述,在骨骼肌细胞的发育过程中,miRNA-128通过对其靶基因MSTN表达的调控来影响骨骼肌细胞的增殖与分化。