牛冠状病毒病是世界范围内的重要牛病,其病原牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)可引起犊牛腹泻、成年牛冬痢以及呼吸系统疾病,且常与其他病原混合感染,给全球养牛业的发展造成了巨大的影响。为防止牛冠状病毒病的广泛传播,我们需要在BCoV感染的初期进行诊断并采取相应防制措施。目前,可用来检测牛冠状病毒病原的方法主要有反转录PCR技术和ELISA等,其中ELISA试剂盒主要依赖进口,成本较高且操作不方便,而反转录PCR只适用于少量样品的检测。为建立操作更方便,检测成本更低且更适合大规模检测病原的方法,本研究拟利用BCoV N基因进行表达纯化,并构建BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库,以期获得结合活性较高的特异性单链抗体,为BCoV新型快速检测试剂的研发奠定前期基础。本研究内容及结果包括:1.BCoV N蛋白的原核表达及小鼠免疫本试验将已构建好的重组表达载体pET28a-N转入大肠杆菌BL21菌株中,成功表达出目的蛋白,经Western blot鉴定正确后分析蛋白可溶性并进行纯化。结果显示重组蛋白条带大小约54 kDa,为可溶性表达,其可被His单克隆抗体特异性识别,纯化后的N蛋白经SDS-PAGE鉴定纯度较高,蛋白浓度为1.5mg/mL。将纯化的重组N蛋白免疫BALB/C小鼠,三次免疫后分离小鼠血清,经ELISA检测其抗体效价,结果显示抗体滴度可达1/10~5,表明本试验制备的重组N蛋白免疫原性良好。2.BCoV N蛋白噬菌体单链抗体库的构建及筛选无菌条件下摘取小鼠脾脏,提取其脾脏淋巴细胞总RNA,RT-PCR反转录合成cDNA后,以此为模板,利用设计的小鼠抗体特异性引物经PCR分别扩增抗体的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),通过Overlap-PCR将胶回收的VH与VL用短肽(linker)连接,获得单链抗体基因(ScFv)。将纯化后的ScFv基因和酶切载体连接后电转入超级感受态细胞中,经扩大培养并纯化后获得了库容为8×10~8的噬菌体单链抗体库。通过4轮特异性抗体的富集和建立的筛选针对N蛋白的ELISA单链抗体检测技术,最终筛选到32株阳性值较高的单链抗体。将32株阳性克隆PCR鉴定并测序,分析序列后发现有19株阳性单链抗体基因正确,选取阳性值较高的5株阳性单链抗体检测其噬菌体抗体结合活性,其中阳性单链抗体ScFv-154与N蛋白的结合活性较高,为进一步探讨单链抗体在牛冠状病毒病诊断和防控技术领域的应用奠定了前期基础。