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芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)是十字花科芝麻菜属植物,具有很强的环境适应能力,耐旱性状尤其突出,是目前最耐旱的油料作物之一。研究表明海藻糖在提高植物抗寒、抗旱、耐盐碱、耐渍以及抗高温等方面具有十分重要的作用。海藻糖磷酸磷酸酶(Trehalose-phosphate Phosphatase,TPP)是磷酸海藻糖形成海藻糖的关键酶。本研究以抗旱/敏感型芝麻菜为材料,克隆了两种TPP基因组DNA全长及其上游启动子序列,并对抗旱/敏感芝麻菜在干旱胁迫/非胁迫下的TPP c DNA序列进行了可变剪切和SNP(Single Nucleotide Polymorphisms)分析,主要结果如下:通过walking和长距离PCR获取了EsTPPA和EsTPPI基因起始密码子上游2004bp、1974bp的DNA序列,分别命名为Esp TPPA和Esp TPPI。启动子结构域预测发现,Esp TPPA和Esp TPPI均含有启动子的基本功能元件CAAT-BOX、TATA-BOX和启动子的其他功能元件如I-BOX、GTGA motif、ARR1AT、CCAAT-BOX、TCP-domain、TAAAG motif、WRKY71OS、W-BOX、LIP19、EBOXBNNAPA和GT1-motif等。另外在EsTPPA基因上游105位处发现一个882bp的内含子序列。克隆了芝麻菜EsTPPA和EsTPPI的基因组DNA全长序列。分析表明芝麻菜EsTPPA基因组全长为3384bp,包含11个内含子(包括5’端非编码区内含子),11个外显子;EsTPPI基因全长为2360bp,包含10个内含子,11个外显子。对抗旱/敏感芝麻菜进行干旱胁迫/非胁迫处理,即抗旱-非胁迫(Drought Tolerant-Non Stress,DT-NS)、抗旱-PEG胁迫(Drought Tolerant-PEG,DT-PEG)、敏感-非胁迫(Drought Sensitive-Non Stress,DS-NS)和敏感-PEG胁迫(Drought Sensitive-PEG stress,DS-PEG)四种处理,扩增EscTPPA和EscTPPI序列。在四种处理条件下共获得52条EscTPPA序列,包含三种剪切形式,分别命名为EscTPPAⅠ、EscTPPAⅡ和EscTPPAⅢ,三种剪切形式均未出现移码突变的情况。EscTPPAⅠ、EscTPPAⅡ和EscTPPAⅢ剪切分别占比75%、23.08%和1.92%。其ORF异常频率分别为31.58%、23.08%和0。DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的Ⅰ型剪切分别为71.43%、100%、78.57%和53.85%,其ORF异常频率分别为21.43%、27.27%、64.29%和15.38%。EscTPPA序列中可用于SNP分析的克隆有49个,In Del、SVS和SNP发生频率分别为0.2996 In Del/Kb、2.10 SVS/Kb和2.15 SNP/Kb,核苷酸多态性值(Pi)为0.00526。DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的In Del频率分别为0.2467、0.4710、0.8636和0.2879 In Del/Kb,SVS频率分别为2.10、2.28、2.73和2.10 SVS/Kb,SNP频率分别为2.10、2.36、2.73和2.16 SNP/Kb。进一步分析发现,转换(A-G、T-C)存在102个,颠换(A-T、A-C、G-T、G-C)存在20个,转换与颠换比为8.1。DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的SAP频率分别为1.33、1.94、1.38和1.33;DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的Ka/Ks分别为1.54、1.25、7和1.7;DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG的转换方式(Ti)分别占88.24%、80%、76.32%和96.67%。Fu and Li’s D,Fu and Li’s F和Tajima’s D的中性检验值均为负数;对ORF编码区进行单氨基酸多态性分析发现,SAP频率为1.46,Ka/Ks值为1.68。在四种处理材料共53个EscTPPI序列中,发现六种剪切形式,分别命名为EscTPPIⅠ、EscTPPIⅡ、EscTPPIⅢ、EscTPPI IV、EscTPPI V和EscTPPI VI,只有IV型剪切出现移码突变并提前终止的情况。EscTPPIⅠ剪切占比84.91%,EscTPPIⅡ占比7.55%,其他为四种剪切分别占1.89%。对四种处理材料EsTPPI基因的六种剪切形式及Ⅰ型剪切中ORF区异常情况分析发现,DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的Ⅰ型剪切分别占75%、90%、84.62%和92.86%,其ORF异常频率分别为43.75%、20%、38.46%和28.57%。EscTPPI序列中可用于SNP分析的克隆有50个,In Del、SVS和SNP发生频率分别0.7222 In Del/Kb、2.04 SVS/Kb和2.09 SNP/Kb,核苷酸多态性值(Pi)为0.0066。DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的In Del频率分别为2.0988、0.1028、2.0833和1.6534In Del/Kb,SVS频率分别为2.22、2.06、3.01和2.51 SVS/Kb,SNP频率分别为2.22、2.06、3.09和2.51 SNP/Kb。转换(A-G、T-C)存在87个,颠换(A-T、A-C、G-T、G-C)存在26个,转换与颠换比为3.35。DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的SAP频率分别为2.26、2.19、3.35和2.95;DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG材料的Ka/Ks分别为1、1.375、1.64和1.67;DS-NS、DS-PEG、DT-NS和DT-PEG的转换方式(Ti)分别占75%、70%、75%和65.79%。四种类型材料的Fu and Li’s D,Fu and Li’s F和Tajima’s D的检验值均为负数;对ORF的编码区进行单氨基酸多态性分析发现,SAP频率为2.22,Ka/Ks值为2.0。综合以上分析,我们发现在胁迫条件下抗旱材料EsTPPA基因的表达量比TPPA-DS-NS、TPPA-DS-PEG、TPPA-DT-NS等三种材料高,另外抗旱胁迫材料的ORF异常频率、In Del频率、SVS频率、SNP频率和SAP频率均较敏感胁迫材料(DS-PEG)和抗旱非胁迫材料(DT-NS)低,碱基转换方式(Ti)比其他三种材料高,表明抗旱材料在胁迫条件下EsTPPA基因的转录过稳定性更高。另外我们对EsTPPI基因的剪切形式分析发现,抗旱材料和敏感材料在胁迫条件下的I型剪切形式增加,In Del频率、SVS频率、SNP频率和ORF异常频率下降,表明抗旱材料在干旱胁迫下EsTPPI基因稳定性更高。以上可能是抗旱芝麻菜抗旱的原因。为了验证EsTPPA和EsTPPI基因的功能,我们将这两种基因分别连接到植物表达载体p CAMBIA2300-35S中并构建成工程菌,通过根癌农杆菌介导转化拟南芥花序,后续将对转EsTPPA和EsTPPI基因的拟南芥进行鉴定。