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羊口疮是由羊口疮病毒(orf virus,ORFV)引起的人兽共患病,能引起山羊、绵羊、多种野生动物和人感染,表现为患病动物的口唇、鼻、舌和乳房等部位出现红肿、丘疹、水泡、脓疱、结痂。羊口疮在世界各地广泛分布,凡是养羊的地方都有该病的发生和流行,我国西北、东北和华南地区均有该病的发生和流行。由于该病对羊群高感染率和感染后易复发,且羊群一旦感染就很难清除,因此该病给我国养羊业造成了严重的危害。目前,关于羊口疮的综合防控几乎处于空白状态,原因是针对该病及其病原基础研究数据缺乏。对ORFV介导炎症发生机制及机体反应的深入了解,是防控该病的科学基础。前动力蛋白2(prokineticin2,PK2)是哺乳动物内源性的小分子分泌蛋白,它与受体G蛋白偶联受体家族作用参与血管生成、炎症反应、免疫调节等重要的生理功能,前动力蛋白2及其介导的下游效应与炎症的发生密切相关。目前,还没有关于PK2在羊口疮病毒感染致炎过程中作用研究,该蛋白在羊口疮病毒介导宿主炎症发生的基本数据是发展基于该蛋白防治方法的基础。本研究对海南黑山羊PK2基因进行了克隆,构建了其真核过表达质粒和RNAi干扰质粒,研究了该蛋白在ORFV致炎中的作用。具体研究内容如下:1.海南黑山羊PK2基因的克隆及序列分析以海南黑山羊组织总RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增了海南黑山羊PK2基因,提交至GenBank(登录号为KY655329)。对PK2进行了相关的生物信息学分析,结果显示,山羊PK2基因长度327 bp,编码109个氨基酸,蛋白分子质量为11.74 Ku;核苷酸序列和氨基酸序列的同源性与鹿的最低分别为41.6%和24.8%,氨基酸同源性与牛的最高为96.3%;基于PK2系统进化树显示,海南黑山羊和牛的亲缘性最高;PK2蛋白存在Prokineticin结构域,是结构保守蛋白;该蛋白存在1个跨膜区,含有信号肽。2.PK2真核过表达载体和RNAi干扰载体构建以pMD18-T-PK2质粒为模板,设计含Bgl II和EcoR I两个酶切位点的特异性引物,构建pEGFP-N1-PK2真核过表达质粒。将pEGFP-N1-PK2转染至OFTu细胞,经荧光显微镜观察和IFA检测,可检测到绿色荧光,表明过表达载体构建成功。设计PK2基因的寡核苷酸引物并构建pSUPER-PK2干扰载体,将pSUPER-PK2转染OFTu细胞,荧光显微镜观察和ELISA检测,结果显示转染pSUPER-PK2 24h内PK2 mRNA表达的抑制效率为51%。3.PK2在ORFV感染OFTu细胞致炎中的研究ORFV感染OFTu细胞后,PK2基因表达上调,表明PK2是病毒感染的效应蛋白之一。用ORFV分别感染转入PK2真核过表达质粒和干扰表达质粒的OFTu细胞,结果显示,PK2过表达后,对白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)有明显的抑制作用;PK2被干扰后,IL-1β和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)的表达显著上调,模式识别受体蛋白(NLPR3)也表现出表达上调。说明PK2蛋白可能通过NLRP3信号通路在ORFV的致炎过程中发挥作用。