人胚胎生殖细胞的分离培养与鉴定

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人胚胎生殖细胞(embryonicgermcells,EGcells)来源于原始生殖细胞的多能性的干细胞,目前,小鼠和人胚胎干细胞的分离培养均取得了一些重大的进展,但是有关人PGCs发育分化、体外分离培养体系及人EG细胞检测等方面还不是很完善,因此对于来源于原始生殖细胞的人胚胎生殖细胞的研究仍然具有十分重要的意义。 1.人胚胎原始生殖细胞的发生、迁移及相关基因的表达。 采用PAS染色,免疫组化(OCT4和hTERT)染色和RT-PCR(OCT4和hTERT)检测,研究了6~19周人胚胎生殖嵴的组织结构以及原始生殖细胞在迁移中的形态学特征、变化及基因(OCT4和hTERT)的表达。结果表明,人胚胎从第6周开始,生殖嵴中有OCT4的阳性细胞,但是数量不多,第8~12周,生殖嵴中表达OCT4的阳性细胞比较多,第13周后,生殖嵴中表达的OCT4逐渐减少,生殖嵴中的PGCs大部分分化;而在6~15周时,hTERT都有阳性细胞的表达,而且表达的阳性细胞比较广泛。 2.不同培养液对人原始生殖细胞原代培养的影响。 比较了7种培养液(包括细胞条件培养液)分离培养人PGCs,结果表明KSR培养液和STO条件培养液适用于PGCs的原代培养;用5种含不同质量浓度LIF的培养液培养人PGCs,结果显示培养液中添加10ng/mLLIF时,原代PGCs出现的平均集落数最多,但与添加5和10ng/mLLIF相比差异不显著,而与添加0和1ng/mLLIF相比差异显著。 3.在成功分离培养人EG细胞后,对人EG细胞进行了鉴定。 以DMEM+15%KSR的无血清培养体系培养,添加细胞因子LIF(10ng/mL)+bFGF(4ng/mL)+Forskolin(10μM),MEF作饲养层,成功分离培养后得到人EG细胞。实验共用56例5~19周流产胎儿,培养得到人EG细胞共16株,其中1株最高传至5代。通过AKP染色、免疫组化染色和RT-PCR方法检测,人EG细胞特异性表达AKP、OCT4、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81、C-kit,和hTERT,这些研究丰富了人EG细胞生物学特性和检测方法。
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