嗜琼胶卵链菌比较基因组学研究及系列琼胶酶基因的克隆表达

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海洋碳源类型多样,碳循环途径复杂,海洋微生物参与到各个碳循环途径中,在海洋碳循环过程中起到重要作用,并针对不同碳源的降解利用进化出不同的代谢类型。新属新种嗜琼胶卵链菌YM01T(Catenovulum agarivorans YM01T)属于γ-变形菌纲交替单胞菌科,分离自中国黄海青岛太平角海域采集表层海水样品,能够降解包括琼胶、吐温80和七叶灵在内的大分子碳水化合物,其中对琼胶的降解能力较强,能够产生高耐热性的琼胶酶。在对其基因组进行测序后发现,菌株YM01T的基因组中包含15个可能的琼胶酶基因。为了了解YM01T的碳水化合物降解能力,研究海洋微生物在海洋碳循环中所起的重要作用,我们对该菌株的基因组序列进行了进一步的分析。  菌株YM01T的基因组大小为5,025,099 bp,利用Glimmer3.0软件共预测得到4,215个基因、54个tRNA。选取交替单胞菌科中5株典型的琼胶降解菌株与菌株YM01T基因组进行比对发现,6个基因组中共有860个同源基因簇,占YM01T基因总数的23.89%,与翻译、核糖体结构和生物转化(J)相关的基因在6个基因组的同源基因中所占比例最高,达到3.18%。菌株YM01T中共有892个特有基因簇,占全基因组的9.24%。其中占比例最高的是预测的一般功能性基因(R,1.22%),其次是碳水化合物的运输和代谢(G,1.15%)、信号转导机制相关基因(T,0.96%)。  对6株细菌的碳水化合物利用相关基因进行进一步研究后发现,同属于嗜琼胶卵链菌属的菌株YM01T和DS2的全基因组中所含的碳水化合物利用相关基因的数目分别为447个和674个,聚类到76个糖苷水解酶家族中,占各自基因组的比例分别为10.70%和17.12%,在6个基因组中比例最高。与此同时,菌株YM01T和DS2在降解利用淀粉、纤维素、结冷胶、琼胶、果胶和木葡聚糖等大分子碳水化合物方面具有明显的基因优势。其中,YM01T中预测得到18个与琼胶降解相关的酶,包括13个β-琼胶酶、2个α-琼胶酶和3个α-新琼二糖水解酶;DS2中含有30个琼胶降解相关基因,包括17个β-琼胶酶基因,1个α-琼胶酶基因和12个α-新琼二糖水解酶。两者中琼胶降解相关基因的数目远远大于其他4个基因组,并且含有α-琼胶酶降解通路,暗示了YM01T和DS2强烈的琼胶降解能力。除此以外,菌株YM01T的基因组中包含63个趋化性相关基因,它们分别与信号识别与转导,应激性,适应性和信号转移功能相关,这暗示了菌株YM01T可以更快地对刺激做出反应,以便适应复杂多变的海洋环境。  对菌株YM01T中的10个琼胶酶基因进行重组表达,获得了3个有活性的琼胶酶蛋白。其中YM01-1和YM01-5的理论分子量分别为37.8 kDa和91.6 kDa,等电点分别为4.66和5.31。对YM01-5进行纯化和酶学性质检测,发现其最适反应温度为37℃,最适反应pH为9.0,在0-37℃放置30 min能够保持80%以上的酶活力,pH6-10之间保持较高的稳定性,在该范围的pH缓冲液中放置12 h后,YM01-5仍能保持80%以上的酶活力。测得的YM01-5的Km值和Vmax值分别为222.2 mg/ml,20.8U/mg。SDS、Ni2+对重组琼胶酶YM01-5有很强的抑制作用,而Mg2+和Fe3+对YM01-5的活性具有促进作用,且随着浓度升高促进作用更加明显。YM01-5以外切酶的形式作用于琼脂糖分子,产生唯一的降解产物新琼二糖。
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