食品中晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-products,AGEs)主要是还原糖及其衍生物的羰基与蛋白质、氨基酸等的游离氨基经过非酶促褐变途径反应所产生的一系列复杂的有机物,主要包括羧甲基赖氨酸(N?-carboxymethyl-lysine,CML)、羧乙基赖氨酸(N?-carboxyethyl-lysine,CEL)和吡咯素等。根据与蛋白质结合状态的不同,AGEs的存在方式包括游离态(与游离氨基酸结合)和结合态(与蛋白质结合)两种。AGEs可在人体内积累引起机体的氧化应激反应,增加糖尿病、尿毒症、阿兹海默症等多种慢性疾病发生的风险。虽然有研究表明,食品的加工方式、储藏条件和食品成分等对其AGEs含量有影响,但是这些因素对对肌肉类食品体系中AGEs产生的具体影响的研究严重不足。本课题以淡水鱼(草鱼、鲶鱼)为对象,(1)研究个体差异对同种肌肉类食品中AGEs含量的影响;(2)研究新鲜度对肌肉类食品AGEs含量的影响,以及不同新鲜度的肌肉类食品在加热过程中AGEs产生量的异同。选取草鱼和鲶鱼作为肌肉类食品的代表是因为两者是我国常见的个体较大的淡水养殖鱼类,可一次性获取大量的来源于不同个体的鲜活样品,且从每条鱼上可取得足够的样品供储藏和加热试验使用,便于研究AGEs含量的个体间差异及加热、储存过程对来源于不同个体的肌肉类食品AGEs含量的影响。在此研究的基础上,(3)以猪肉为研究对象,验证基于淡水鱼鱼肉的相关研究结果,进一步研究常用肉类添加剂(NaCl,NaNO2)对不同储藏时间的猪肉中AGEs含量在加热前后的影响;(4)以肉类模拟体系(肌纤维蛋白-还原糖-脂肪酸)以及溶液模拟体系(赖氨酸-还原糖-脂肪酸)为对象,探究NaCl、NaNO2对肌肉类食品AGEs含量的影响机制。1.以新鲜活杀的草鱼和鲶鱼为对象,建立鱼肉中游离态和结合态CML、CEL的提取净化方法及HPLC-MS/MS检测条件。在此基础上分析不同个体鱼肉中游离态和结合态CML、CEL的含量及不同热处理条件(100°C;5,10,30 min)对鱼肉中游离态和结合态AGEs含量的影响。草鱼和鲶鱼中AGEs的加标回收率为:游离态CML 100.6–121.9%,CEL 103.4–121.3%;结合态CML 80.6–101.1%,CEL 79.3–105.3%。草鱼(n=15)背部鱼肉中游离态CML、CEL含量分别为1.3±1.2和0.2±0.1 mg/kg,而结合态CML、CEL含量分别为1.3±0.5和2.8±1.0 mg/kg。不同草鱼个体中AGEs含量存在很大的差异性,尤其对游离态CML来说,不同草鱼个体间含量的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)可达89%。鲶鱼(n=21)游离态CML、CEL含量分别为0.11±0.09和6.5±7.2 mg/kg;结合态CML、CEL含量分别为0.7±0.3和3.1±2.7 mg/kg。除了结合态CML,其他三种AGEs的相对标准偏差均大于80%,表明不同鲶鱼个体之间的AGEs含量存在很大的差异,尤其是游离态CEL(RSD=111%)。鱼肉中结合态CML和CEL含量随加热时间的延长而增加。加热30 min后,草鱼鱼肉中结合态CML的含量增加了2.4–10.8倍,结合态CEL含量增加了27–242%;鲶鱼鱼肉中结合态CML含量增加了2.1–8.5倍,结合态CEL增加了28–224%。但是,加热对游离态CML和CEL含量的影响不显著。2.以新鲜活杀的草鱼和鲶鱼为样品,埋入碎冰中分别储藏0–21天,分析不同储藏时间内鱼的背部白色肌肉生肉及其加热过程中(100°C;5,30 min)游离态和结合态CML、CEL含量的变化。在3周的冰藏期内,草鱼和鲶鱼中游离态和结合态CML、CEL含量都没有显著性的变化。而随着冰藏时间的延长,即鱼肉新鲜度的降低,鱼肉中结合态CML和CEL在加热过程中的产生量显著增加。鲶鱼鱼肉在100°C加热5 min后生成的结合态AGEs(mg/kg protein)如下:CML,31.0±10.7(0天),39.0±16.3(10天),64.4±33.6(21天);CEL,2.9±5.9(0天),5.9±6.8(10天),16.1±10.6(21天)。加热30 min后,结合态CML生成量为54.0±13.7(0天),91.8±43.3(10天),154.0±79.2(21天);CEL生成量为17.2±8.2(0天),27.3±7.6(10天),50.0±20.3(21天)。与新鲜样品相比,储藏3周后,鲶鱼鱼肉在100°C加热5 min后结合态CML的增加量从214%增大到318%,加热30 min后增加量从302%增大到614%;加热对三周冰藏期间鲶鱼中结合态CEL的增加分别为123–162%(5 min)和184–292%(30 min)。同样的,100°C加热5min后草鱼肌肉中结合态AGEs产生量分别为:CML,5.6±2.3(0周),8.4±3.5(1周),10.3±2.9(2周),13.6±3.3(3周);CEL,3.9±6.6(0周),5.2±6.3(1周),5.0±3.8(2周),9.1±3.6(3周);加热30 min后结果分别为:CML,21.3±5.3(0周),27.5±5.7(1周),35.6±10.4(2周),49.3±8.9(3周);CEL,18.6±6.1(0周),19.3±9.2(1周),26.7±6.2(2周),36.3±8.7(3周)。在储藏3周期间内,加热引起的AGEs含量变化分别为:CML 167–233%(5 min)和215–580%(30 min);CEL 135–163%(5 min)和237–348%(30 min)。储藏时间越长,因加热引起的AGEs含量变化越大。3.以猪里脊肉为样品,分别添加不同含量的NaCl(0–5%)和NaNO2(0–150mg/kg)以及两者的混合物(NaCl 2.5%,NaNO2 50/150 mg/kg),研究盐类的添加对不同储藏期(0°C,0–8天)猪肉脂肪氧化程度(TBARS值)及颜色的影响以及商业杀菌条件(121°C,10 min)处理后不同储藏期样品中结合态CML和CEL含量的变化。结果显示,添加了NaCl的猪肉样品TBARS值在储藏期内不断变大,且NaCl添加浓度越高,TBARS值越大,而添加了NaNO2的猪肉样品TBARS值随着NaNO2添加浓度的增加而不断减小,而在不同储藏期内TBARS值没有明显的变化。8天的冷藏期内,生猪肉中结合态AGEs的含量并没有随着盐的种类和添加量发生显著的变化。加热使得新鲜猪肉中的结合态CML增加160–248%,CEL增加205–269%,并且随着储存时间的延长,加热过程中产生的AGEs不断增大。NaCl的添加加速了猪肉中结合态AGEs在热处理过程中的形成,5%NaCl添加后,新鲜猪肉在加热过程中CML的产生量增加了278%,CEL的产生量增加了293%。而与NaCl结果相反,NaNO2的添加降低了猪肉中结合态CML和CEL在加热过程中的产生量。添加150 mg/kg NaNO2后,新鲜猪肉在加热过程中CML的产生量降低了53%,CEL的产生量降低了31%。当NaCl(2.5%)和NaNO2(50/150 mg/kg)同时添加时,加热后猪肉中AGEs的含量与未添加任何盐类的猪肉中AGEs含量相近,且远低于添加2.5%NaCl的猪肉样品中AGEs的含量。4.从猪肉中提取肌纤维蛋白(MFP),分别与葡萄糖(G)、核糖(R)和油酸(OA)建立蛋白模拟体系,添加不同含量的NaCl(1%,2%)和NaNO2(50,150mg/L),于121°C加热10 min后分析模拟体系中AGEs含量的变化;另以赖氨酸(L)与葡萄糖、核糖和油酸建立溶液模拟体系,添加盐类后加热分析体系中AGEs含量的变化。结果显示,添加油酸后,蛋白质模拟体系中CML和CEL含量分别增加了72.5%和11.5%;在溶液模拟体系中油酸则具有抑制CML和CEL产生的趋势。在这两类模拟体系中,核糖参与AGEs形成的反应速率远高于葡萄糖和油酸,含有核糖的模拟体系中CML含量比葡萄糖体系高出近9倍,CEL含量高出3–5倍;核糖体系CML含量比油酸体系高出50倍,CEL含量高出20倍。在蛋白质模拟体系中,NaCl的添加对MFP,MFP/G,MFP/R三个体系中CML和CEL的产生没有明显的影响趋势,而相比于未添加NaCl的模拟体系,MFP/OA,MFP/G/OA和MFP/R/OA三个体系中CML和CEL含量降低了20–60%,NaCl浓度的增加并没有进一步抑制CML、CEL产生的趋势。在溶液模拟体系中,L/OA,L/G/OA,L/R/OA三个体系中CML含量随着NaCl的添加降低了10–30%,CEL含量并没有明显的变化趋势。除MFP/R和MFP/R/OA两个模拟体系,其他体系中CML和CEL在NaNO2添加后含量增加了20–40%。而NaNO2对赖氨酸溶液体系中CML和CEL含量的影响并不明显。本项目从肌肉类食品的原材料出发,利用HPLC-MS/MS检测方法,综合研究了肌肉类食品中游离态和结合态AGEs(包括CML和CEL)含量受样品个体差异、新鲜度(储藏条件)、肉制品常用盐类添加剂以及加热条件等的影响规律,利用模拟体系进一步从反应原理上分析了各因素对复杂食品体系中AGEs产生的影响机制。本课题系统性的研究可以帮助人们理解肌肉类食品中AGEs的产生机制以及加工、储藏条件等因素对复杂食品体系中AGEs含量的影响机制,为人们合理的选择肉类食品的加工处理方式、提高食品的质量与安全性提供数据参考。对进一步研究抑制食品加工过程中AGEs的产生,指导食品安全生产具有十分重要的意义。