【摘 要】
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端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它的核心催化区由蛋白质催化亚基—端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase:TERT）和RNA亚基—端粒酶RNA（Telomerase RNA:TER）两部分组成。与其他逆转录酶相比,端粒酶最大的特点就是能够以自身携带的一段RNA序列为模板,反复合成端粒DNA,从而解决真核生物线性染色体的末端复制问题,维护基因组的完整性。然而,端粒
【基金项目】
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国家自然科学基金（编号:31870788）；
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端粒酶是一种特殊的逆转录酶,它的核心催化区由蛋白质催化亚基—端粒酶逆转录酶（Telomerase reverse transcriptase:TERT）和RNA亚基—端粒酶RNA（Telomerase RNA:TER）两部分组成。与其他逆转录酶相比,端粒酶最大的特点就是能够以自身携带的一段RNA序列为模板,反复合成端粒DNA,从而解决真核生物线性染色体的末端复制问题,维护基因组的完整性。然而,端粒DNA的合成是一个复杂而精致的过程,中间涉及到端粒DNA的延伸、复制的精确终止、DNA-RNA杂交链的解离及DNA与RNA解离后发生移位,使DNA重新和模板区配对,开始新一轮的合成等多个步骤。目前对这些过程的分子机制并不清楚,而高分辨率的三维结构是阐明分子机制的关键。此外,端粒酶的结构与功能具有物种特异性,研究不同物种端粒酶的结构与功能,才能全面而深刻的理解端粒酶的作用机制。但目前对端粒酶的结构知之甚少,尤其是对酵母端粒酶的空间结构更是一无所知。本文以假丝酵母（Candida tropicalis与Candida albicans）端粒酶为研究对象,通过大肠杆菌表达系统获得了高纯度的假丝酵母端粒酶逆转录酶（Candida tropicalis TERT,Ct TERT与Candida albicans TERT,Ca TERT）。然后与RNA组装成有活性的复合体,在体外利用引物延伸实验对其延伸活性进行了研究,结果发现:（1）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外只能延伸一轮,不具有反复合成能力;（2）假丝酵母端粒酶发挥活性不需要TER中的Pseudoknot（PK）及Three-way-junction（TWJ）等结构元件,只要有模板区（Template）的存在就能进行端粒DNA的合成;（3）假丝酵母端粒酶逆转录酶在体外具有典型的逆转录酶功能,能够以任意RNA为模板催化相应DNA的合成。接着,我们利用X射线晶体衍射技术及小角散射技术（Small angle X-ray scattering,SAXS）对假丝酵母端粒酶逆转录酶的结构进行了研究,最终成功解析出包括TERT单蛋白晶体结构(Ct TERT178-879:2.47?,Ct TERT158-745:2.84?)及TERT与TWJ的复合体(Ct TERT158-879-TWJ:2.85?,Ca TERT177-867-TWJ:2.98?,Ca TERT95-867-TWJ:3.46?)在内的多套高分辨率的晶体结构。Ct TERT晶体结构显示,Ct TERT的C端结构域（C-terminal extension,CTE）占据了之前在其他物种TERT结构中观察到的环形腔,呈“闭合”状态。通过晶体结构分析及SAXS实验发现,这种闭合状态并不是晶体堆积造成的,而是TERT的一种固有属性,并且这种“闭合”属性不受RNA的影响。与Ct TERT呈“闭合”状态的空间构象刚好相反,Ca TERT的TRBD-RT-CTE形成环形,呈“开放”状态,并且Ca TERT-TWJ复合体是二聚体。我们通过结构分析及生化实验验证,揭示了Ca TERT-TWJ形成二聚体的结构基础。此外,分析Ct TERT及Ca TERT与TWJ的复合体晶体结构,揭示了酵母中TERT识别TWJ的分子机制。重要的是,我们直接证明了TWJ的P6.1与TERT的CTE之间的相互作用。此后,又通过SAXS及活性测定实验证明了TERT的CTE是可以灵活转动的,并且这种构象变化是TERT的内在属性。有趣的是,分子动力学模拟结果显示,CTE构象的变化能够使RNA与DNA的杂交双链发生解离,随后我们通过功能实验对其进行了验证。在分析Candida TERT晶体结构时,发现在TRBD的N端存在一个U形loop结构,我们把它命名为U-motif,通过结构分析及序列比对发现此结构在端粒酶中非常保守,进一步深入的研究发现U-motif能够调控端粒DNA的合成。最后,我们根据对CTE及U-motif的结构分析及功能实验,提出了端粒酶合成端粒DNA的分子模型。
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