【摘 要】
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已有研究表明团头鲂内凝集素(MaINTL)可以增强团头鲂巨噬细胞的吞噬作用,但具体的调控机制尚不清楚。本研究通过原核表达获得重组团头鲂内凝集素(rMaINTL),rMaINTL注射团头鲂幼鱼后对肾脏进行数字表达谱测序,对差异基因进行GO富集及KEGG通路分析以确定吞噬相关信号表达情况。rMaINTL处理巨噬细胞后通过荧光显微镜及透射电镜对巨噬细胞形态、骨架及内部结构进行观察。rMaINTL处理细胞
【基金项目】
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江苏省自然科学基金(No.BK20181071); 团头鲂内凝集蛋白增强巨噬细胞杀伤作用的机制研究,江苏海洋大学研究生科研创新项目,编号KYCX20-2885;
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已有研究表明团头鲂内凝集素(MaINTL)可以增强团头鲂巨噬细胞的吞噬作用,但具体的调控机制尚不清楚。本研究通过原核表达获得重组团头鲂内凝集素(rMaINTL),rMaINTL注射团头鲂幼鱼后对肾脏进行数字表达谱测序,对差异基因进行GO富集及KEGG通路分析以确定吞噬相关信号表达情况。rMaINTL处理巨噬细胞后通过荧光显微镜及透射电镜对巨噬细胞形态、骨架及内部结构进行观察。rMaINTL处理细胞后通过Western blotting及qRT-PCR检测吞噬相关信号分子在蛋白水平及分子水平的表达情况,抑制剂阻断后对信号分子的表达、actin变化和吞噬功能变化进行检测。同时也研究了海藻多糖对巨噬细胞吞噬作用的调控,通过糖结合实验筛选可以与MaINTL结合的海藻多糖,通过qRTPCR及Western blotting检测海藻多糖对MaINTL表达的影响。通过海藻多糖孵育巨噬细胞检测海藻多糖对巨噬细胞吞噬作用的调控。本研究旨在阐明rMaINTL介导巨噬细胞吞噬功能的分子与细胞机制与海藻多糖对巨噬细胞吞噬作用的影响。结果如下:(1)幼鱼肾脏差异基因富集分析表明,在rMaINTL注射幼鱼后,对照组和实验组都测得21.59 M的转录组原始数据,对照组和实验组测序质量大于20%的分别为97.67%和97.76%,比对到团头鲂数据库的比对率分别为93.48%和94.21%。用DEseq2进行整体分析,共有差异基因201个,其中上调121个,下调80个。在GO富集分析中差异基因主要富集在生物过程和分子功能上,在生物过程中富集最显著的是细胞过程和代谢过程,在细胞组分中细胞解剖学实体、含蛋白质复合体富集最明显,在分子功能中催化活性、结合活性和跨膜活性的富集最为显著。KEGG通路分析结果表明差异基因在吞噬体、肌动蛋白细胞骨架调控、PI3K-Akt信号通路、抗原处理和呈递、C型凝集素受体等信号通路中显著富集,其中吞噬相关的关键信号包括CDC42、Rac1等,免疫相关的基因CXCL11、CCR4、CD74等表达量上升。结果表明,rMaINTL注射幼鱼后可以促进吞噬及免疫相关基因的表达。(2)rMaINTL处理巨噬细胞后细胞的骨架发生明显变化,细胞表面积变大、伪足伸展,细胞内部结构也出现变化,胞内内质网扩张出现吞噬体与脂滴,在rMaINTL孵育后Factin/G-actin的比值上升。以上结果表明,rMaINTL孵育巨噬细胞后可以促进巨噬细胞形态和结构的变化,形态结构变化后的巨噬细胞的吞噬功能及杀伤功能得到提升。(3)rMaINTL处理后吞噬相关信号分子CDC42、PCDC42/Rac1、WASP、Arp2的表达量均发生上调,巨噬细胞骨架蛋白F-actin/G-actin的比值升高,巨噬细胞的吞噬功能也得到提升。在CDC42抑制剂阻断后WASP、Arp2的表达量发生下调,在WASP抑制剂阻断后CDC42的表达量未发生显著变化,WASP及Arp2的表达量下降。CDC42抑制剂及WASP处理巨噬细胞后,F-actin/G-actin的比值下降,巨噬细胞对嗜水气单胞菌的吞噬作用下降。rMaINTL通过调控CDC42、WASP的表控制Arp2/3复合体的表达,调控巨噬细胞骨架F-actin的聚合作用,进而调控巨噬细胞的吞噬功能。(4)通过糖结合实验筛选到海带多糖和岩藻多糖可以与MaINTL结合,岩藻多糖及海带多糖孵育巨噬细胞后INTL的表达量在蛋白水平和mRNA水平上都得到显著提升。两种海藻多糖孵育巨噬细胞后,巨噬细胞骨架发生变化,巨噬细胞伸出伪足,巨噬细胞吞噬功能获得提升。
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