前言:随着经济发展和生活方式改变,糖尿病发病风险也不断增加,且对民众的健康产生严重威胁。糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease,DKD）是一种常见的糖尿病并发症,其发病机制主要与糖代谢异常、肾脏血流动力学改变、免疫炎症因素、遗传因素、氧化应激等有关。大量的研究表明在糖尿病众多发病机制当中,昼夜节律紊乱是不容忽视病因之一。昼夜节律为一种生物体中的自然现象,其主要是基于生物钟进行调节,使机体适应自然环境的变化。相关研究发现生物钟与太阳光周期变化、物质代谢存在一定同步性。血糖在物质和能量代谢过程中发挥着重要作用,相关实验研究发现血糖水平和生物钟基因表达关系密切,生物钟基因异常对胰岛素分泌量和节律性都会产生影响,因而生物钟节律紊乱成为了糖尿病的主要影响因素之一。相关实验研究表明对DM小鼠而言,其生物钟节律紊乱情况下,血糖水平明显提高,且肾重系数、血肌酐指标都有所增加,由此可推断出生物钟节律紊乱会导致血糖增加,和DKD发生率增加有关。Toll样受体（TLRs）为一种膜受体,和免疫调节功能密切相关,其可以通过特定分子模式引发炎性反应,在免疫系统激活中作用很重要。在高血糖、高血脂的刺激下足细胞和肾小球系膜细胞的Toll样受体被激活,进而促进了细胞因子、趋化因子的表达与释放,从而导致炎症和纤维化,形成糖尿病肾病的病理改变。研究人员发现TLRs的表达与昼夜节律有一定的关系,并且在高表达Bmal1和Clock基因的日本medaka胚胎细胞（OLHdr R-e3）中检测到TLR9表达增加。此外,在依赖TLR9的脓毒症小鼠模型中,发现疾病的严重程度取决于脓毒症诱导的时间,这与TLR9表达和功能的日常变化一致。在分离的巨噬细胞中,LPS通过TLR4诱导昼夜节律的相移,并抑制核心昼夜节律基因Bmal1的峰值表达。褪黑素（MT）是一种具有抗氧化及抗炎作用的吲哚类激素,它由大脑松果体分泌。既往研究表明褪黑素具有肾脏保护作用,该作用主要是通过抑制肾脏的炎症反应得以实现,但其在DKD中的疗效和作用机制尚需进一步研究。方法:第一部分:不同浓度褪黑素干预高糖刺激的大鼠肾小球系膜细胞48小时。Western blot检测各组总蛋白中CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、My D88、NF-κB的蛋白表达。Western blot检测各组总蛋白中TGFβ1、CollagenⅣ及FN的蛋白表达。实时荧光定量PCR法（Quantitative Real-time PCR）测定各组细胞中TGFβ1、CollagenⅣ及FN的m RNA的表达情况;ELISA试剂盒检测各组细胞培养上清中炎症因子IL-1β和IL-6的分泌。第二部分:SPF级雄性小鼠适应性喂养一周后,将8周龄的2型糖尿病db/db小鼠随机分成:db/m组、db/db组和db/db+MT组。各组小鼠置于12h-12h明暗交替的环境饲养,早7AM开灯,记为ZT0时,晚7PM时关灯,记为ZT12时。db/db+MT组每天（ZT12-次日ZT0）给予褪黑素加入饮用水中（首先将褪黑素溶于无水乙醇中,再加入适量生理盐水加以稀释,配制成褪黑素浓度为0.2%的生理盐水溶液）,同时给予db/m组和db/db组小鼠相同时间内饮用含有等量乙醇的生理盐水溶液,db/m组、db/db组和db/db+MT组三组小鼠均给予普通饲料。喂养至20周龄。每周对小鼠体重称量一次,每月检测一次血糖,且采集其尿液,并通过酶联免疫法检测尿白蛋白和尿NGAL相关的指标,并确定出尿白蛋白/尿肌酐比率。对20周龄小鼠麻醉后通过摘眼球取血,心脏灌流后留取肾组织。对采集的血样进行处理后通过酶联免疫法检测血肌酐和尿素氮。对制备的组织切片进行HE、PAS和Masson染色。CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、NF-κB的表达水平基于免疫组化方法进行检测。通过Western blot方法测定肾组织CLOCK、BMAL1、DEC1、TLR2、My D88、NF-κB、TGFβ1、CollagenⅣ及FN的蛋白表达。实时定量PCR法检测肾组织TGFβ1、CollagenⅣ及FN m RNA的表达。ELISA试剂盒检测各组肾组织匀浆IL-1β、IL-6的表达情况。第三部分:染色质免疫沉淀（Ch IP）结合PCR技术鉴定体内条件下转录因子CLOCK和DEC1与TLR2启动子特异序列的结合情况。应用双荧光素酶报告技术检测转录因子CLOCK和DEC1对TLR2启动子转录活性的影响。使用脂质体转染DEC1si RNA,实时定量PCR法验证转染效率,Western Blot检测各组细胞DEC1、TLR2、My D88、NF-κB的蛋白表达水平。结果:第一部分:HG组大鼠肾小球系膜细胞生物钟基因CLOCK、BMAL1表达水平较NG组明显降低（P＜0.05）,DEC1表达水平较NG组显著增加（P＜0.05）;HG组大鼠系膜细胞内TLR2、My D88、NF-κB、TGFβ1、CollagenⅣ及FN的表达和NG组相比明显增加,细胞培养上清液中IL-1β、IL-6的水平增加。褪黑素有效升高高糖刺激的系膜细胞内CLOCK、BMAL1表达水平,降低DEC1表达水平,减少TLR2、My D88、NF-κB的产生。褪黑素可下调高糖引起的细胞因子TGF-β1的高表达,同时还可抑制细胞外基质Ⅳ型胶原和FN的产生,降低细胞培养上清液中IL-1β、IL-6的水平。第二部分:褪黑素降低db/db小鼠尿ACR和尿NGAL,改善肾脏病理改变,减少系膜基质增生等肾脏病理结构改变,明显降低db/db小鼠体重和血糖。褪黑素可以上调2型糖尿病db/db小鼠肾组织内时钟基因CLOCK、BMAL1表达水平,降低DEC1表达水平,下调TLR2/My D88/NF-κB通路,减轻肾组织内炎性状态,减少Ⅳ型胶原和FN的产生,发挥肾脏保护作用。第三部分:染色质免疫沉淀（CHIP）结果显示,CLOCK和DEC1均可与TLR2启动子结合。双荧光素酶检测结果显示,转录因子DEC1可显著上调p GL3-TLR2-wt的荧光素酶表达水平,而转录因子CLOCK对于野生型TLR2启动子和突变型TLR2启动子的转录活性都没有明显的影响。脂质体转染DEC1 si RNA实验中,四组细胞干预处理48h后,与HG组相比,HG+DEC1-si RNA组的DEC1 m RNA的表达显著下调（P＜0.01）。与HG组相比,HG+DEC1-si RNA组和HG+MT组DEC1、TLR2、My D88和NF-κB蛋白表达量显著下调（P＜0.05）。HG组与HG+si NC组以上指标之间的差异无统计学意义。结论:第一部分:大鼠肾小球系膜细胞在高糖状态下出现时钟基因表达异常,TLR2/My D88/NF-κB信号通路被激活,IL-1β、IL-6等炎症因子的分泌增多,TGFβ1信号通路表达上调,从而导致大鼠肾小球系膜细胞的细胞外基质CollagenⅣ和FN分泌增加,褪黑素干预可有效调节时钟基因,对上述信号通路有一定抑制作用,降低了大鼠肾小球系膜细胞细胞外基质的分泌。第二部分:褪黑素能降低db/db小鼠尿ACR和尿NGAL,改善肾脏病理改变,减少系膜基质增生,减轻db/db小鼠的体重和血糖水平。褪黑素可能通过调节2型糖尿病db/db小鼠肾组织时钟基因,下调TLR2/My D88/NF-κB信号通路,从而抑制TGFβ1信号通路的激活,减轻肾组织内炎性状态和纤维化,发挥肾脏保护作用。第三部分:转录因子DEC1可能通过与TLR2启动子结合并激活其转录,上调TLR2/My D88/NF-κB信号通路,从而激活TGFβ1信号通路的激活,导致肾脏炎症状态和纤维化,引起肾脏损伤。