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大豆[Glycine max(L)Merr]含有丰富的营养成分和许多对有益健康的生物活性物质,其中大豆皂角苷就是活性物质一种。目前一经发现超过100余种成分的大豆皂角苷,他们对人有益健康特性足由他们的糖苷配基和糖成分组成影响的。大豆皂角苷能够改善大豆风味和营养,因此在大豆营养育种上有极大的利用价值。然而,由于其A组皂角苷被认为是大豆食品加工中苦涩味的来源,所以育种除掉该成分也是个重要育种目标。野生火豆(Glycine soja Sieb&Zucc.)是栽培大豆的祖先种,含有许多有用的基因和性状,是大豆育种的重要遗传资源。大豆Soja亚属的皂角苷在日本和韩国已经被研究,甚至有用的突变体也被应用于大豆育种。然而,中国大豆亚属的皂角苷成分情况仍然不清楚。为此,本研究目的就是:(1)鉴定中国大豆亚属的皂角苷成分和遗传突变,(2)调查其遗传多样性和地理的分布,(3)测定其含量,(4)了解遗传变异水平和挖掘有用的基因资源,为将来提高大豆营养水平的育种服务。研究结果如下: 1.使用薄层层析法(TLC)测定了来自中国各地的3805份野生大豆资源。结果鉴定出24个皂角苷成分,包括4个新发现的成分,这些成分被划分6个组(A,DDMP,B,E,α和β),构成32个表型。新发现的4个新成分是出现在18份野生资源的K-αg(β组),1份Ab型野生资源的HAb-αg(β组),一份sg-7变异体资源的A-αg和其衍生成分KA-αg,其中A-αg成分是A组皂角苷的生物合成的前体成分。另外还检测出8份在碳C-22上缺少第二个耱基的A0变异体资源,2份E组Bd成分高含量资源和4份A组Ae成分高含量、缺少Aa和αg成分的资源。基于本研究测定出的新皂角苷成分和其它稀有的新颖成分,皂角苷成分的名称被重新归类和整理。 2.分析了4个新发现成分(K-αg,HAb-αg,A-αg和KA-αg)的分子结构。本研究发现一个新的A组皂角苷生物合成关键位点Sg-7。这个位点是通过一个野生大豆(No5306)隐形突变体sg-7而发现的,在C-22碳位羟基不能连接上阿拉伯糖导致种子中A-αg成分积累,同时伴随衍生体KA-αg出现。A-αg(C-3糖基化的皂草精醇A)是大豆种子的一种A组成分稳定的合成前体。KA-αg作为sg-7突变体的一个副产品,相比A-αg它在糖苷配基C-29碳位上有一个乙酰基。 在18份野生大豆资源中发现K-αg(C-29-乙酰化的H-αg),它是α组成分,在皂草精醇H糖苷配基的C-29碳位上有一个额外的乙酰基(-COCH3)。在一个Ab型野生大豆资源中发现HAb-αg(C-29-羟基化Ab),它在糖苷配基C-29碳位上存在一个-OH基,是一个C-29羟基化的SS-A。 3.使用薄层层析法检测了2959份中国大豆地方品种的皂角苷成分。检测出13个成分,分属于A、DDMP、B、α和β的5个组。α组成分(H-αg、I-αg、K-αg)和β组成分(KA-αg)是首次在栽培大豆中检测到。Sg-1a和Sg-1b共显性等位基因频率分别是393%和607%,Sg-4等位基因非常稀有,约为007%。本次调查没有发现隐性等位基因sg-3和sg-7存在于中国栽培大豆中。 皂角苷表型在植物学上的数量和质量性状上的分布显示,Sg-1位点与大豆进化有密切关系;小粒种子、蔓生、黑种皮、无限生长习性、阔叶、低油、春大豆型积累较高的SSg-1a频率。地理上,黄河流域Sg-1a频率较高(>60%)。结合考古文献、Sg-1a频率分布和在中国西北存在相对较高的组α成分频率,推测大豆起源于渭河的中、下游流域,也就是黄河中上游流域。 4.分析了中国野生大豆皂角苷表型和基因型的地理分布和遗传分化。鉴定出中国野生大豆32个皂角苷表型,并根据10个已知基因和候选基因的位点给出这些表型的基因型。4个成分基因有较高的频率:Sg-1a积累达788%的频率,他的等位基因Sg-1b为210%;Sg-4和Sg-6e频率分别是307%和137%。中国东北部和南部显示高的遗传多样性,但是东北地区有较多的新颖变异表型类型(AuAe、A0、A0Bc、Bd、αH、αI、αJ、αK、AbβHAb)。基因分化(Fst)分析暗示,Sg-4和组α基因位点Sg-6e、Sg-6h、Sg-6i和Sg-6j是影响中国野生大豆的地理遗传结构和分化的重要因子。中国南部区域野生大豆含有较高的Sg-4基因。中国野生大豆明显地可以区分南北两个地理组,遗传分化主要是发生在纵向的纬度间的地理区域。根据大豆皂角苷成分,中国野生大豆遗传结构上不同于日本和韩国的野生大豆,后两者很可能是在冰河期从中国南部迁移的。 5.基因测序揭示了皂角苷Sg-1位点多态的分子特征和自然发生的A组缺失(A0表型)突变机理。使用8份A0突变体、1份sg-7突变体(AβKA表型)、72份Aa(Sg-1a)和74份Ab(Sg-1b)型野生资源。结果显示,Sg-1位点有较低的保守性;从Aa和Ab型中分别检测出8个等位多态和10个等位多态。Aa和Ab有9个氨基酸差异,之外还有8个同义密码子差异。Sg-1a和Sg-1b之间还发现了2个过渡态序列(Sg-1a7和Sg-1b2)。A0表型检测到至少有3种变异机制,涉及到4个等位多态变异(sg-10-b2、sg-10-b3、Sg-1b-0和Sg-1b-01)。sg-10-b2有两处碱基缺失发生在第72和73氨基酸密码。sg-10-b3在第254氨基酸发生一个终止密码(TGA)。Sg-1-0和Sg-1b-01是新颖的A0突变体,它们携带正常的Ab型基因序列,然而不能够编码Ab皂角苷,很可能是该基因以外的未知原因引起的,有待解明。表型突变体sg-7和A0是改良大豆苦涩味育种的重要基因资源。 6.对106份包括27种皂角苷表型野生大豆资源的胚轴和子叶进行了皂角苷含量测定。结果显示,典型野生大豆比半野生型含有高的总皂角苷含量;α组缺失类型野生大豆在胚轴和子叶都有高的A组含量和相对低的B组和E组含量,而含有α组的类型相反。这些结果暗示,α组成分是从A组系列成分合成而来而非B组成分。基于这些分析和结合皂角苷生物合成路径上成分鉴定,提出五个位点Sg-6e,Sg-6h,Sg-6i,Sg-6j和Sg-6k参入α组成分合成。浓度测定证实了两个Bd成分积累变异体AaBcEαJ和AbEIJα;基于各种成分在种子中产出量提出了两个高Bd积累的机制和大豆胚轴和子叶在A组皂角苷表达的差异机制。筛选出11份表型为A0,A0Bc,AaBcEαJ,AbEαIJ和AβKA的A组含量低、B组+DDMP含量高的优异资源。