论文部分内容阅读
猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis,TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）引起的一种猪的以呕吐、腹泻和严重脱水为主要症状的接触性肠道传染病。该病对猪最为易感,可引起两周龄以内的仔猪高发病率和高死亡率,对世界各国养猪业造成了巨大的经济损失。目前,TGEV的入胞机制还不是很清楚。在本研究中,主要利用单颗粒示踪技术对TGEV在猪睾丸细胞（Swine testis cells,ST cells）的入胞过程进行研究,揭示了 TGEV在入胞过程中与ST细胞的动态相互作用,并描绘出了整个动态过程,对TGE的预防和治疗具有一定意义。本研究内容共分为以下四部分:1 TGEV的荧光标记及其多克隆抗体的制备本研究中,成功利用亲脂性荧光染料DiD对TGEV进行了标记。用ST细胞对TGEV进行大量扩增,收集病毒液依此进行低速离心去除细胞碎片、超速离心浓缩病毒液、密度梯度离心纯化。将纯化的病毒中加入DiD染料混匀,室温振荡孵育,过滤去除多余染料后进行验证。共聚焦显微镜成像和单个TGEV病毒粒子的荧光强度统计结果显示,TGEV病毒粒子被成功标记,并且各病毒粒子的荧光强度也较均一。对比标记前后的TGEV的TCID50结果显示,标记前后病毒毒力无明显差别,表明DiD标记对病毒的感染无明显影响。另外,TGEV多克隆抗体的制备是将TGEV利用β-丙内酯和紫外双重灭活,以灭活病毒作为免疫原免疫BALB/c小鼠。待免疫小鼠血清ELISA效价达到105以后,收集小鼠血液分离血清后纯化。通过SDS-PAGE及IFA验证,结果显示,纯化抗体无杂蛋白污染,并且抗体对TGEV具有特异性结合作用。TGEV的荧光标记和TGEV多抗对完成后续实验奠定了重要基础。2 TGEV利用网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞作用入胞的研究网格蛋白（clathrin）和小窝蛋白（caveolae）介导的内吞作用是细胞中两种常见的内吞方式,为了研究在ST细胞中clathrin和caveolae对TGEV入胞的作用,首先用针对 clathrin 和 caveolae 的特异性抑制剂 CPZ、pitstop2、nystatin、MβCD 分别预处理 ST细胞,随后感染TGEV进行IFA和qPCR,结果显示抑制剂处理后可以明显减少TGEV的感染,表明clathrin和caveolae对TGEV的感染具有重要作用。为了进一步揭示TGEV依赖clathrin和caveolae入胞的动态过程,分别构建了融合表达荧光蛋白标签的 clathrin 和 caveolae 的载体,Clc-EGFP、Cav1-EGFP 和 Cav1-mKO2。将 ST 细胞分别转染Clc-EGFP和Cav1-EGFP,24h后将DiD标记的病毒加入转染的细胞中进行活细胞示踪,结果显示,在TGEV吸附到细胞上以后,可以通过clathrin和caveolae介导的内吞作用入胞,并且整个过程在2min以内完成。通过分析TGEV的动力学发现,病毒粒子整个入胞过程可以分为两个阶段:前一个阶段病毒粒子位移较小,以低速率做限制性运动;后一阶段病毒粒子位移变大,以高速率做直接运动。由于TGEV可以通过clathrin和caveolae介导的内吞作用这两种途径入胞,为了确定TGEV通过两种途径入胞的比例,将ST细胞同时转染Clc-EGFP和Cav1-mKO2两种质粒,24h后加入DiD标记的病毒,通过活细胞实时示踪TGEV在双转染细胞上的入胞,统计结果显示,有60.7%的TGEV可以通过clathrin介导的内吞作用入胞,39.3%可以通过caveolae介导的内吞作用入胞。3肌动蛋白对TGEV入胞作用的研究已经有研究表明肌动蛋白（actin）对一些病毒的入胞具有重要作用。为了研究actin对TGEV的入胞是否具有影响,利用actin抑制剂CytoD对ST细胞进行处理,随后感染TGEV进行IFA和qPCR,结果显示,抑制剂处理的细胞可以明显减少TGEV的感染,表明actin对TGEV感染具有重要作用。为了揭示TGEV和actin相互作用的动态过程,构建了融合表达荧光蛋白标签的actin的载体,Actin-EGFP。将ST细胞转染Actin-EGFP,24h后加入DiD标记的TGEV进行活细胞示踪,结果显示,TGEV的入胞依赖于actin,通过分析动力学发现,病毒粒子整个入胞过程同样可以分为两个阶段:前一个阶段病毒粒子位移较小,以低速率做限制性运动;后一阶段病毒粒子位移变大,以高速率做直接运动。并且通过统计发现TGEV和actin的相互作用时间与TGEV通过clathrin和caveolae介导的内吞作用入胞一样,整个过程也在2min内完成,表明在TGEV在内吞进入细胞过程中需要招募actin辅助病毒粒子入胞。4发动蛋白2对TGEV入胞作用的研究发动蛋白（dynamin）是细胞内一种介导膜分离的具有GTP水解酶活性的蛋白,已经发现dynamin可以影响多种病毒的内吞作用。为了研究dynamin对TGEV的入胞是否具有影响,首先利用dynamin特异性抑制剂dynasore对ST细胞进行处理,随后感染TGEV进行IFA和qPCR,结果表明,抑制剂可以明显抑制TGEV的感染。另外为了进一步验证该结果,构建dynamin2（Dyn2）抑制性载体K44A和针对Dyn2的shRNA,将ST细胞分别转染抑制性载体K44A和shRNA,随后感染TGEV进行qPCR,结果显示,抑制载体和shRNA可以明显抑制TGEV的感染,表明Dyn2对TGEV的感染至关重要。为了研究在入胞过程中TGEV和Dyn2的动态相互作用,构建了融合表达荧光蛋白标签的Dyn2的载体,Dyn2-EGFP。将ST细胞转染Dyn2-EGFP,24h后加入DiD标记的TGEV进行活细胞示踪,结果显示,TGEV的入胞依赖于Dyn2,通过分析动力学发现,病毒粒子整个入胞过程同样可以分为两个阶段:前一个阶段病毒粒子位移较小,以低速率做限制性运动;后一阶段病毒粒子位移变大,以高速率做直接运动。但是通过统计发现TGEV和Dyn2的相互作用时间较TGEV和clathrin、caveolae和actin相互作用时间短,在病毒粒子入胞前20s左右才开始招募Dyn2,表明TGEV在内吞入胞过程的后期需要招募Dyn2介导膜分离,使病毒粒子成功入胞。