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哺乳动物睾丸发育及精子形成是雄性重要的生命活动,起到物种延续的作用。在睾丸发育过程中,大量生殖相关基因相互协作共同维持睾丸正常发育和各个阶段精子正常分化。湖羊作为我国著名绵羊品种,以其繁殖力高及耐高温等优良特点被广泛养殖。Nanos3是生殖细胞正常发育的重要调控者。研究证明,当Nanos3基因敲除后,雌性和雄性小鼠生殖器官均无法形成正常生殖细胞,对于抑制生殖细胞发生凋亡具有重要作用。睾丸间质细胞主要功能为分泌睾酮,其对于维持雄性特征及生殖细胞正常生长具有重要意义。长链非编码RNA（LncRNA）被研究其通过与目标基因或目标蛋白相互调控,对睾丸发育及精子发生具有重要影响。但是,目前关于Nanos3表达及功能对于湖羊睾丸发育的研究鲜有报道。因此,本试验以Nanos3基因为切入点,探究Nanos3基因在湖羊睾丸中的表达定位及其与互作lncRNA对睾丸间质细胞的功能影响,并且通过dCas9/sgRNA对其内源性激活以检测其功能,揭示Nanos3对睾丸发育及精子发生的调控机制,为深入研究提供基础。试验一、Nanos3在湖羊睾丸中的表达及其对体外湖羊睾丸间质细胞功能的影响本试验通过免疫组化法、ELLSA法、HE染色、qRT-PCR和Western-blot等方法,进行相关基因和蛋白表达水平、睾酮水平、组织形态和凋亡的研究。结果表明:随着湖羊月龄的增加,Nanos3在9Mo和24Mo的mRNA及蛋白表达量显著低于3Mo表达量（P<0.05）;Nanos3在各级生精细胞及间质细胞和间质细胞中均有表达:通过siRNA-Nanos3干扰后,3β-HSD和CYP11a1睾酮合成相关芳香化酶mRNA和蛋白表达量显著降低（P<0.05）,凋亡相关基因BAX/Bcl-2的mRNA和蛋白比值显著升高（P<0.05）。对湖羊进行能量限制饲喂后,湖羊睾丸各级生精细胞数量变少且会发生凋亡。通过对限饲后睾丸组织进行检测,Nanos3 mRNA和蛋白水平表达显著降低（P<0.05）,验证得到凋亡相关基因BAX/Bcl-2的mRNA和蛋白比值显著升高（P<0.05）。综上所述,Nanos3可能参与间质细胞中睾酮分泌,并且能够抑制凋亡发生。试验二、靶向Nanos3的LncRNA筛选及其对体外湖羊睾丸间质细胞睾酮分泌的影响本试验通过实验室前期测序结果筛选对Nanos3具有调控功能的LncRNA,然后通过分析该LncRNA与Nanos3的位置关系及筛选其该LncRNA有效干扰siRNA,利用ELISA、Western blot、CCK-8、qRT-PCR等技术分析其对睾酮分泌、睾丸间质细胞凋亡和增殖的影响。结果显示:根据测序结果分析对可能存在调控关系的LncRNA共有9个,但是在性成熟前后对Nanos3具有调控作用的只有LncRNA NAS。LncRNA NAS在湖羊在睾丸中的表达量显著高于其它组织（P<0.05）,LncRNANAS表达量随着日龄增加而呈现上升趋势,其中24Mo其表达量显著高于D5、3Mo和9Mo（P<0.05）,9Mo中表达量显著高于D5和3Mo（P<0.05）,D5和3Mo中表达量差异不显著（P>0.05）;相比对照组,干扰组中睾丸间质细胞中睾酮分泌水平显著升高（P<0.05）,睾酮分泌相关基因和蛋白表达量显著升高（P<0.05）,细胞凋亡相关基因Bax/Bcl-2的mRNA和蛋白水平显著降低（P<0.05）,细胞增殖活力增强（P>0.05）。进一步说明LncRNANAS可能通过调控靶基因影响湖羊睾丸间质细胞睾酮的分泌。试验三、Nanos3基因的CRISPR dCas9转录激活系统建立本试验通过使用CRISPR dCas9技术建立Nanos3基因激活系统,主要通过针对目的基因启动子不同区域设计sgRNA、对不同位置sgRNA随机进行组合,以此进行Nanos3基因进行内源性激活的研究。本试验中内源性激活系统选择pcDNA-dcas9-p300 core,以此系统来对目的基因Nanos3进行内源性激活,便于对其功能进行深入研究。首先确定该目的基因Nanos3在染色体内分布位置,在其启动子不同区域设计sgRNA,并将该sgRNA通过限制性内切酶BbsI连接于载体pSPgRNA,构建含有sgRNA的载体系统。将pcDNA-dcas9-p300 core与含有sgRNA的载体系统的两个质粒成功转染进湖羊成纤维细胞内以激活Nanos3基因表达。定量结果显示,sgRNA3的激活效率显著高于sgRNA1和2（P<0.05）,利用不同sgRNA进行组合对目的基因进行激活,sgRNA 1和sgRNA 3两个sgRNA共同转染与sgRNA 1、sgRNA2和sgRNA 3三个sgRNA共同转染效率最高,其与sgRNA 2和sgRNA 3共同转染的激活效率差异不显著,sgRNA 1和sgRNA2共同转染的激活效率最低。