[研究背景]卵巢组织冷冻和自体移植是目前保存幸存癌症患者生育力最理想的方式。延续了卵巢的内分泌及生殖功能。全球已有数百例移植手术,通过该技术获得活产数超过160例,且移植后60%左右患者在三个月内恢复内分泌功能。目前均采用卵巢组织皮质移植,属于无血管吻合的移植。因此,移植初期面临新生血管建立和缺血-再灌注损伤,持续数日的缺血最可能引起深度和不可逆的缺血-再灌注损伤。在这段时间内,约有60-70%的始基卵泡丢失,明显影响移植后卵巢组织内分泌功能的恢复,同时缩短移植物的寿命。因此,保护移植后的卵巢组织中的卵泡,特别是始基卵泡就显得尤为重要。卵泡丢失途径主要两条:（1）大部分始基卵泡,在储备池内发生闭锁而退化死亡,这种细胞死亡属于细胞凋亡或另一种程序性细胞死亡;（2）由静止状态被过度选择继续生长并进入生长卵泡池,但随后大部分闭锁。因此,本研究利用小鼠的卵巢冷冻保存-自体移植模型从以下两部分探讨始基卵泡丢失的原因及其干预措施,探索卵巢组织冻存-移植过程中的保护性措施,该实验结果将为提高人类卵巢组织冷冻保存-自体移植的效果提供新的策略。第一部分细胞焦亡在小鼠卵巢组织冻存-移植过程中的作用研究[研究目的]已有研究表明细胞焦亡在心、肝、肾、脑等脏器的缺血-再灌注损伤中发挥了重要作用,迄今为止,卵巢组织冷冻保存-自体移植过程中是否会激发细胞焦亡尚不清楚。因此,本研究利用小鼠的卵巢冷冻保存-自体移植模型探讨细胞焦亡在小鼠卵巢组织冷冻保存和自体移植中的作用及卵巢组织冻存-移植过程中细胞焦亡的分子调控机制,并探讨焦亡抑制剂对小鼠卵巢移植物功能的影响,为提高人类卵巢组织冷冻保存-移植技术的效果提供技术支持。[研究方法]1.实验分组:6周龄ICR小鼠,分为四组,每组10只:（1）自然对照组:既不冻存,也不进行自体移植;（2）新鲜移植组:摘除卵巢当天不进行冷冻,直接进行自体移植;（3）冷冻移植组:摘除卵巢当天进行卵巢组织冷冻保存,冷冻2周后再自体移植;（4）冷冻焦亡抑制组:摘除卵巢当天进行卵巢组织冷冻保存,冷冻2周后再自体移植,移植后当天、术后1天、术后2天连续3天给予腹腔注射Ac YVAD-CMK（Caspase-1抑制剂）2mg/kg的剂量。2.移植后3天,取出卵巢移植物,Western blot检测四组小鼠卵巢组织Caspase-1和NLRP3蛋白的表达;ELISA方法检测四组小鼠卵巢组织匀浆IL-1 β和IL-18水平;Western blot和免疫组化检测自然对照组和冷冻移植组小鼠卵巢组织Caspase-1 和 Caspase-11 蛋白的表达。3.移植后14天,ELISA方法检测四组小鼠血清雌二醇浓度;取出卵巢移植物,HE染色组织形态学观察卵泡形态及密度。[研究结果]1.Western blot结果显示:新鲜移植组、冷冻移植组和焦亡抑制组卵巢移植物中的Caspase-1和NLRP3蛋白的表达水平均显著高于自然对照组（P<0.05）;焦亡抑制组卵巢移植物中的Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平较冷冻移植组显著降低（P<0.05）;与新鲜移植组相比,冷冻移植组Caspase-1和NLRP3蛋白的表达水平显著性增加（P<0.05）;冷冻移植组的卵巢移植物中的Caspase-1和Caspase-11蛋白的表达水平均显著高于自然对照组（P<0.05）。2.组织匀浆IL-1 β和IL-18水平:新鲜移植组、冷冻移植组和焦亡抑制组IL-1β和IL-18水平均显著高于自然对照组（P<0.05）;与新鲜移植组相比,冷冻移植组的IL-1 β和IL-18水平显著升高（P<0.05）,而焦亡抑制组IL-1 β和IL-18水平较冷冻移植组明显降低（P<0.05）。3.移植后14天雌二醇浓度:新鲜移植组、冷冻移植组和焦亡抑制组的雌二醇浓度显著低于自然对照组（P<0.05）;与新鲜移植组相比,冷冻移植组雌二醇水平明显降低,有统计学差异（P<0.05）;与冷冻移植组相比,焦亡抑制组雌二醇水平明显升高（P<0.05）。4.卵巢移植物的卵泡密度（1）总卵泡密度比较:新鲜移植组、冷冻移植组和焦亡抑制组卵巢移植物的总卵泡密度与自然对照组相比明显降低（P<0.05）;焦亡抑制组卵巢移植物的总卵泡密度与冷冻移植组相比明显增多（P<0.05）。（2）始基卵泡密度比较:新鲜移植组、冷冻移植组和焦亡抑制组卵巢移植物的始基卵泡密度与自然对照组相比明显降低（P<0.05）:焦亡抑制组卵巢移植物的始基卵泡密度与冷冻移植组相比明显增多（P<0.05）。（3）每组生长卵泡占比:新鲜移植组、冷冻移植组和自然对照组相比,生长卵泡比例增加（P<0.05）;焦亡抑制组与冷冻移植组相比,生长卵泡比例降低（P<0.05）。[结论]1.冷冻保存-移植卵巢组织过程中会引起细胞焦亡;2.本实验条件下,应用焦亡抑制剂可以保护小鼠卵巢组织冻存-自体移植的始基卵泡数目,对卵泡的继续发育没有明显影响,不损伤卵巢的内分泌功能,有望延长移植物寿命;3.卵巢组织冻存-移植过程会造成生长卵泡数目的增加。第二部分抑制mTOR信号通路在小鼠卵巢组织冻存-移植过程中作用研究[研究目的]鉴于第一部分实验结果,卵巢组织冻存-移植后激发了生长卵泡比例的增加,考虑是始基卵泡在这个过程中发生了过度激活。研究表明,mTOR通路在卵泡激活的启动过程中发挥关键作用,颗粒细胞中的mTOR信号被过度激活会加速颗粒细胞的分化,从而导致静息状态的始基卵母细胞提前被激活,缩短移植物的寿命。因此,本研究利用小鼠的卵巢冻存-自体移植模型探讨mTOR信号通路在卵巢组织冻存-自体移植中的作用,为进一步探究卵巢组织冻存-移植后的始基卵泡丢失的分子调控机制,并探讨mTOR特异性抑制剂雷帕霉素对小鼠卵巢组织冻存-自体移植过程中功能的影响,将为优化和改进这一重要的生育保存技术确定潜在的新靶点。[研究方法]1.实验分组:6周龄ICR小鼠,分为四组,每组10只:（1）自然对照组:既不冻存,也不进行自体移植;（2）新鲜移植组:摘除卵巢当天不进行冷冻,直接进行自体移植;（3）冷冻移植组:摘除卵巢当天进行卵巢组织冷冻保存,冷冻2周后再自体移植;（4）mTOR抑制组:摘除卵巢当天进行卵巢组织冷冻保存,冷冻2周后再自体移植,移植后当天、术后1天、术后2天连续3天给予腹腔注射雷帕霉素2mg/kg的剂量。2.移植后7天,ELISA方法检测四组小鼠血浆雌二醇和AMH水平;取出卵巢移植物,HE染色观察卵泡形态及密度;Western blot和免疫组化检测四组小鼠卵巢组织P-S6K蛋白的表达。3.移植后28天,ELISA方法检测四组小鼠血浆雌二醇和AMH水平;取出卵巢移植物,HE染色观察卵泡形态及密度。[研究结果]1.卵巢移植物的卵泡密度（1）总卵泡密度比较:小鼠卵巢组织自体移植后7和28天,新鲜移植组、冷冻移植组和mTOR抑制组卵巢移植物的总卵泡密度与自然对照组相比明显降低（P<0.05）;mTOR抑制组卵巢移植物的总卵泡密度与冷冻移植组相比无显著性差异。（2）始基卵泡密度比较:小鼠卵巢组织自体移植后7和28天,新鲜移植组、冷冻移植组和mTOR抑制组卵巢移植物的始基卵泡密度与自然对照组相比明显降低（P<0.05）;mTOR抑制组卵巢移植物的始基卵泡密度与冷冻移植组相比明显增多（P<0.05）。（3）每组生长卵泡占比:小鼠卵巢组织自体移植后7和28天,新鲜移植组、冷冻移植组和自然对照组相比,生长卵泡比例增加（P<0.05）;mTOR抑制组与冷冻移植组相比,生长卵泡比例降低（P<0.05）。2.Western blot和免疫组化结果显示:mTOR抑制组较冷冻移植组显著性降低（P<0.05）。3.雌二醇和AMH水平:小鼠卵巢组织自体移植后7天和28天,新鲜移植组、冷冻移植组和mTOR抑制组的雌二醇和AMH水平均显著低于自然对照组（P<0.05）;移植后7天,mTOR抑制组雌二醇和AMH水平与冷冻移植组相比,明显降低（P<0.05）。移植后28天,mTOR抑制组与冷冻移植组相比,雌二醇水平降低（P<0.05）,但AMH水平无明显差异。[结论]1.冷冻保存-移植卵巢组织过程中会引起始基卵泡过度激活;2.mTOR及其介导的信号通路参与了始基卵泡的激活;3.本实验条件下,应用mTOR抑制剂雷帕霉素可以保护小鼠卵巢组织冻存-自体移植的始基卵泡数目,对卵泡的继续发育没有明显影响,不损伤卵巢的内分泌功能,有望延长移植物寿命;4.雌二醇浓度和窦卵泡密度有相关性,AMH水平与初级卵泡和次级卵泡密度有相关性,二者联合可以监测自体移植后卵泡的发育状况。