高产谷氨酰胺转胺酶茂原链霉菌的诱变育种

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谷氨酰胺转胺酶是一种常用的食品添加剂,茂原链霉菌是工业上用来生产该酶的主要菌株。目前国内企业生产所用菌株的谷氨酰胺转胺酶产量仍然较低,本文主要从菌株选育和发酵条件的优化两方面进行研究,以期提高菌株的谷氨酰胺转胺酶产量。研究确立了菌株筛选的方法,分别为96孔浅板筛选、96孔深板筛选和菌落印迹法筛选这三种高通量筛选方法。96孔浅板为标准的酶标板,每孔最大装液量为250μL。96孔浅板每孔装150μL发酵液,发酵96h后测定酶活;96孔深板每孔装150μL或200μL发酵液,发酵96h后测定酶活;菌落印迹法选用滤纸或纤维素膜进行印迹,初筛时菌体在高氏一号平板上萌发3天,发酵培养基平板发酵4天后,加定量的反应液进行显色。96孔板发酵为定量筛选,比菌落印迹法显色更精确,但是菌落印迹法筛选周期较短,能够提高菌株筛选效率。运用UV、常温常压等离子诱变(ARTP)两种物理诱变剂和亚硝基胍(NTG)、亚硝酸钠(NIT)、硫酸二乙酯(DES)三种化学诱变剂对茂原链霉菌进行诱变选育,并对UV-DES复合诱变方法进行初步探索。结合高通量筛选方法,对每种诱变剂的最佳诱变条件进行了探索,在最佳诱变条件下筛选了38000株突变菌,试管复筛1522株,摇瓶发酵验证447株,高产株TGase酶活达到9U/mL,较诱变出发菌株提高了91%。在菌株的诱变选育过程中,对每轮诱变的高产菌株进行自然选育以防菌株退化,共自然选育了6700株突变菌。5种诱变剂对菌株的诱变包含18种诱变组合,以菌株产酶提高率为考察指标,对不同组合方案进行了评估。对诱变得到的3株高产菌与诱变出发菌株进行发酵代谢特征的比较,结果显示诱变后的菌株生长有明显的延迟现象,对甘油、氨基氮的代谢情况以及菌株的产酶情况与诱变出发菌株有显著差异。对诱变高产株进行了碳氮源的优化,结果显示,菌株20141026GSCN52的最佳碳源是葡萄糖,添加量为1.75%。本文还研究了甲壳素对茂原链霉菌发酵产酶的影响,发现0.05%的甲壳素添加量即对茂原链霉菌发酵产酶有极显著的促进效果。甲壳素促进菌株产酶的机理可能是,菌株生长过程受甲壳素的胁迫,进而促使次级代谢产物增多。甲壳素也可能作为分散剂使得菌株生长过程中聚集形成的菌丝球致密性较低,通透性增强,有利于菌株的生长和Pro-TGase向胞外的分泌,从而提高菌株产酶。菌株的诱变选育、发酵培养基的优化以及发酵促进剂甲壳素的添加,都不同程度提高了茂源链霉菌的谷氨酰胺转胺酶产量,这三种手段在发酵工业中具有很高的实用价值。
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