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副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是一种革兰阴性菌,多生活在河口和海洋环境中,能够引起虾红体病、鱼类皮肤溃烂等水产动物疾病,人感染后会导致急性肠胃炎,严重者感染败血症甚至死亡。副溶血性弧菌之所以能成为一种重要的食源性致病菌,与其能适应不同的生存环境密不可分。为了在复杂的外界环境生存,副溶血性弧菌需要在单细胞浮游状态与多细胞群集状态如形成生物被膜之间实现转换。研究发现,副溶血性弧菌在不同生存方式的转换受到信号因子环二鸟苷酸（c-di-GMP）的调控。C-di-GMP是细菌中普遍存在的第二信使,它由含有GGD（/E）EF结构域的双鸟苷酸环化酶催化合成,由含有EAL或是HD-GYP结构域的磷酸二酯酶催化降解。C-di-GMP参与调控细菌中多种生理生化过程,例如细菌的运动性、生物被膜的形成、细菌毒力等等。本研究针对副溶血性弧菌中具有单个GGD（/E）EF结构域的蛋白进行了功能探究。1.副溶血性弧菌中含GGD（/E）EF结构域的蛋白功能初探通过生物信息学分析发现,副溶血性弧菌RIMD 2210633基因组含有编码44个含GGD（/E）EF结构域的蛋白质基因,对这些蛋白质进行进一步结构域分析后筛选出了仅有含有单个GGD（/E）EF结构域的双鸟苷酸环化酶,分别是VP2076、VPA0059、VPA0068、VPA0184、VPA0202、VPA0360、VPA0739、VPA0925、VPA1457和VPA1478。在副溶血性弧菌RIMD 2210633菌株中对这些基因分别进行敲除,并检测了这些基因缺失突变株的运动能力,结果发现副溶血性弧菌缺失vpa0202或vpa1478后,细菌的爬动能力显著增强。通过回补实验证明了GGEEF是VPA0202和VPA1478发挥调控功能的重要的酶活性位点。通过交叉回补实验发现,VPA0202和VPA1478功能可互补,这说明VPA0202和VPA1478是功能相似的蛋白。本论文针对VPA0202的功能展开了更深入的探究,并将VPA0202命名为GefA。2.GefA的生物学功能研究副溶血性弧菌具有两套鞭毛系统:侧生鞭毛和极生鞭毛。为了进一步探究GefA对副溶血性弧菌爬动能力的调控机制,检测了在ΔgefA菌株中分别缺失了侧生鞭毛基因lfg B和极生鞭毛基因flg E之后细菌的运动能力,结果发现当lfg B缺失后ΔgefA/lfg B的爬动能力显著降低,这表明GefA通过影响侧生鞭毛基因来调控副溶血性弧菌的爬动能力。将侧生鞭毛相关基因的启动子区与荧光报告质粒融合,通过检测荧光报告基因的转录水平发现,与野生型相比,在ΔgefA中侧生鞭毛基因的转录水平显著升高,这也表明GefA是通过影响侧生鞭毛基因表达来调控副溶血性弧菌的爬动能力的。C-di-GMP信号通路是调控细菌生物被膜形成的关键信号因子,通过检测了ΔgefA菌株生物被膜的形成能力发现,与野生型相比ΔgefA生物被膜形成能力显著下降。通过检测胞外多糖基因在ΔgefA中的转录水平发现,在ΔgefA和CΔgefAGGAAA中胞外多糖基因的转录水平显著降低,而回补菌株CΔgefA的生物被膜形成能力恢复到野生型水平。这表明GefA可作为一种双鸟苷酸环化酶参与调控副溶血性弧菌生物被膜的形成。在副溶血性弧菌中,ScrABC是目前已知的参与调控胞内c-di-GMP浓度的操纵子,当scr ABC基因缺失时,细菌胞内c-di-GMP浓度增加,此时细菌的爬动能力显著下降,生物被膜形成能力显著升高。GefA是一个具有双鸟苷酸环化酶活性的蛋白,为了探究ScrABC与GefA之间是否存在相互调控作用,检测在Δscr ABC菌株中GefA对细菌爬动以及生物被膜形成的调控作用,结果发现与Δscr ABC相比,Δscr ABC/gefA菌株的爬动能力没有显著差异,但是其生物被膜的形成却显著降低。这说明在副溶血性弧菌胞内的c-di-GMP浓度急剧升高的环境下,GefA对细菌的爬动能力没有调控作用,但依然可以促进细菌生物被膜的形成。有报道称c-di-GMP对细菌毒力具有调控作用。为了探究GefA是否对副溶血性弧菌致病性具有调控作用,通过斑马鱼攻毒模型,比较感染不同菌株斑马鱼的存活率发现,感染ΔgefA菌株后斑马鱼的存活率显著降低,这表明GefA参与调控副溶血性弧菌的毒力。进一步的研究发现,GefA对副溶血性弧菌的III型分泌系统1（T3ss1）的相关基因具有调控作用,通过斑马鱼攻毒实验发现,当副溶血性弧菌缺失gefA后,细菌的毒性升高;而在ΔgefA中缺失T3ss1后,其毒性较ΔgefA要低,这说明GefA通过T3ss1调控副溶血性弧菌的毒力。另一方面,由于GefA对侧生鞭毛也具有调控作用,且鞭毛也是细菌重要的毒力因子,于是为了探究鞭毛是否参与GefA介导的对副溶血性弧菌毒力的调控作用,在ΔgefA中缺失鞭毛基因lfg B和flg E后发现,其毒性也较ΔgefA要低,这说明鞭毛系统也参与了GefA介导的对副溶血性弧菌毒力的调控作用。综上所述,本研究发现副溶血性弧菌c-di-GMP合成酶GefA会抑制细菌的爬动能力和致病性,增强生物膜形成。这些实验结果扩展了对副溶血性弧菌中c-di-GMP合成酶的认识,以及它在群体行为和致病性中的作用。