研究背景和目的：　　 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是慢性肝炎的主要致病因子之一，目前全世界约有一亿七千万人受到感染，约占全球人口的3％。HCV的感染很容易持续存在，引起肝脏慢性炎症，进而导致肝脏纤维化、肝硬化及肝癌等严重后果。肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，是影响慢性肝病预后的重要环节。肝纤维化是纤维增生和纤维分解失衡的结果，其做为一动态过程，属可逆性病变。肝纤维化的特征是以胶原为主的细胞外基质(ECM)各成份因合成增多、降解相对不足而在肝内过量沉积。　　 目前共识，肝星状细胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纤维化发生、发展的中心环节。在各种致病因素作用下，静止期HSC被激活并增殖、转化为肌成纤维细胞(myofibroblasts，MFB)，它可产生大量的ECM，包括：Ⅰ～Ⅳ型胶原、透明质酸、结缔组织生长因子、纤维连接蛋白等。目前认为Ⅳ型胶原、Ⅲ型前胶原肽、层粘连蛋白及透明质酸是最具代表性的肝纤维化血清学指标。而转化生长因子-β1(TGF-β1)是迄今所知道的最强的促HSC活化的细胞因子，在肝纤维化中起着核心作用。　　 核心区基因是HCV基因组中最为保守的结构区域，有证据表明它编码的C蛋白是一种多功能蛋白质，能参与病毒复制、脂质代谢紊乱、丙型肝炎的慢性化、肝纤维化和肝癌的发生发展以及抑制免疫反应、影响干扰素的治疗效果。我们推测HCV核心蛋白可能参与了ECM的合成与降解的调控，从而影响着肝纤维化的发生、发展。　　 本实验的目的是扩增HCV C基因的全序列，构建能够稳定表达核心蛋白的细胞株，采用体外培养的肝星状细胞作为研究的靶细胞，来研究核心蛋白对HSC活化及合成ECM的影响，以期了解HCV核心蛋白的致肝纤维化机制，为研究HCV的致病作用奠定基础。　　 研究内容和方法：　　 提取HCV阳性病人血清中的病毒总RNA，用AMV RTase XL逆转录获得cDNA，根据GenBank数据库中HCV1b和2a型全序列，设计一对能扩增5末端约1100bp片段的引物，PCR产物连接入pGEM-T Easy载体，蓝白筛选得到阳性克隆，委托公司测序。测序结果利用DNAstar软件及GenBank资源进行序列分析、比对。进而以质粒pGEM-T Easy-HCV1100为模板特异性扩增HCV C基因全序列，构建真核表达载体pEGFP-C3-HCV-C转染人肝癌细胞系HepG2细胞，筛选获得稳定表达核心蛋白的HepG2-HCV-C细胞株。并用SDS-PAGE和WesternBlot鉴定C蛋白的表达和抗原特异性。用1640培养基作阴性对照，ELISA法检测HepG2-HCV-C和HepG2细胞株培养液中TGF-β1的表达。另外用这两株细胞的上清液来培养人肝星状细胞系LX-2细胞，同时用DMEM培养LX-2细胞作对照，分别制备细胞爬片，用免疫细胞化学染色法分别检测LX-2细胞中人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、结缔组织生长因子(CTGF)和纤维连接蛋白(FN)的表达情况。同时ELISA法分析上述三种方式培养的LX-2细胞其上清液中人Ⅳ型胶原(ColⅣ)、Ⅲ型前胶原肽(PⅢ NP)、透明质酸(HA)和人层粘连蛋白(LN)分泌表达的情况。所有数据采用SPSS11.0统计软件进行统计分析。　　 结果：　　 本实验从HCV阳性病人的血清标本中扩增出了完整的HCV C基因的编码序列，经同源性分析，与国内HCV1b型分离株的核苷酸及氨基酸的同源性均为95％以上。成功构建HCV C基因全序列的真核表达载体pEGFP-C3-HCV-C，转染人肝癌细胞系HepG2细胞，经SDS-PAGE和Western Blot鉴定获得稳定表达核心蛋白的HepG2-HCV-C细胞株。　　 ELISA检测结果显示，HepG2-HCV-C细胞1～6天培养液中TGF-β1的量(pg/ml)(110.00±28.45，290.00±61.16，455.00±28.46，871.67±41.35，939.16±49.85，935.00±53.06)显著高于HepG2细胞(0，12.50±38.78，35.83±29.35，76.67±15.63，122.5±32.89，124.16±29.35)，F=21984.81，p＜0.001。两株细胞间同一时间点的两两比较均显示P＜0.01，提示HCV C蛋白表达的肝癌细胞系分泌TGF-β1的量明显增加。　　 免疫细胞化学染色结果显示用HepG2-HCV-C细胞株上清液培养的LX-2细胞人α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅳ型胶原(ColⅣ)、结缔组织生长因子(CTGF)、纤维连接蛋白(FN)四种因子均为弥漫阳性，细胞染成深褐色；用HepG2培养的LX-2细胞呈局灶性棕黄色，DMEM培养的LX-2细胞染色阴性。　　 另外经分析，LX-2(HepG2-HCV-C)组ColⅣ的值明显高于LX-2(HepG2)组(F=3977.80，p＜0.001)和LX-2(DMEM)组(F=1305.29，p＜0.01)；HA的值明显高于LX-2(HepG2)组(F=13365.12，p＜0.001)和LX-2(DMEM)组(F=2604.61，p＜0.001)；LN的值明显高于LX-2(HepG2)组(F=880.92，p=0.001)和LX-2(DMEM)组(F=8573.96，p＜0.001)。同样，LX-2(HepG2-HCV-C)组PⅢ NP的值与LX-2(HepG2)组比较有差异(F=23.67，p=0.04)，与LX-2(DMEM)组相比也有显著增高(F=88.63，p=0.011)。提示核心蛋白对HSC活化及ECM合成存在一定影响。　　 结论：　　 1.利用PCR技术扩增了HCVC基因的全序列，经同源性分析，与1b型分离株的核苷酸及氨基酸的同源性均为95％以上。　　 2.利用基因工程技术成功构建了HCV C基因全序列的真核表达载体，体外转染获得稳定表达核心蛋白的HepG2-HCV-C细胞株。为进一步研究HCV核心蛋白的功能奠定了物质基础。　　 3.ELISA分析显示，HCV核心蛋白表达的细胞系中有TGF-β1的合成和分泌增加。提示HCV C蛋白可能上调TGF-β1的表达。　　 4.ELISA和免疫细胞化学染色分析显示，HCV核心蛋白表达的细胞系能促进LX-2细胞多种细胞外基质的合成，提示HCV C蛋白可能通过活化肝星状细胞，参与肝纤维化形成中ECM合成与降解的调控。为进一步研究HCV C蛋白的致肝纤维化机制和HCV的致病机理积累了资料。