脑放射治疗(以下简称脑放疗)是脑肿瘤综合治疗中的重要组成部分,是最有效治疗方法之一。但放射性脑损伤是脑放疗后的严重并发症,认知功能障碍是脑放射治疗最常见和严重的长期并发症。随着肿瘤综合治疗水平的提高,恶性脑肿瘤患者生存时间明显延长,出现脑放疗后认识功能缺陷的几率增加。消除脑放疗引起的迟发副作用将显著提高恶性脑肿瘤患者的生活质量,减轻社会负担,故研究脑放疗后认知功能障碍的发病机制及治疗有着非常重要的意义。关于国内外对于放射性脑损伤所造成的认知功能障碍的研究,大多关注于临床资料分析及流行病学调查,基础实验研究较少,缺乏系统全面的动物实验及临床相关性研究。据以往研究推论,髓鞘损伤、细胞再生障碍、血管损伤、炎症等有可能引起放射性脑损伤,放疗后这些变化导致认知功能障碍的具体机制仍未清楚。在中枢神经系统中,钙通道的功能非常重要,它们能介导神经元正常功能,激活后参与许多生理及病理信号传导。急性中枢神经系统损伤等引起的神经退行性变被报道与凋亡和钙内流引起的氧化应激有关。在脑缺血的研究中,钙通道阻滞剂尼莫地平治疗可以保护脑组织,减少神经元细胞死亡。钙通道拮抗剂在脑外伤、脑缺血等方面不仅具有选择性扩张脑血管作用,而且还具有很强的改善记忆作用,可以促进神经功能恢复。钙通道失调是否在脑放疗后认知功能障碍中起了关键作用,钙通道拮抗剂是否可以改善和预防放射性脑损伤引起的认知功能障碍,值得期待。本研究旨在调查老年胶质瘤患者是否脑放疗后出现与放疗相关的认知功能障碍,并进一步通过大鼠全脑放疗模型,以研究脑放疗引起认知功能障碍的发病机制以及探讨钙通道拮抗剂尼莫地平对于脑放疗后迟发性认知功能障碍治疗和预防的可行性。第一部分老年胶质瘤患者放疗后认知功能障碍的临床研究目的:分析老年胶质瘤的临床特征及治疗选择,评估老年胶质瘤的预后相关因素,观察老年胶质瘤术后接受脑放疗患者的生存期及其认知功能障碍,为进一步研究提供初步临床研究数据。方法:共选取2009年1月-2012年12月在我院神经外科进行治疗的197例胶质瘤患者,随访时间≥3年,对所有患者临床及病理资料及随访结果进行研究分析。根据国际常用年龄分类标准,首次发病≥60岁患者定义为老年胶质瘤患者。统计老年胶质瘤患者共43例,随访完成为40例,均通过开颅手术或者活检证实为脑胶质瘤,术后行放化疗或者单纯放疗、化疗或者保守治疗,入选患者既往无精神疾病史,既往理解及交流能力正常。随访完成40例老年胶质瘤患者中,分析数据包括患者的性别、年龄、肿瘤位置、术前KPS评分、病理、治疗方法(包括手术切除程度、术后放疗及放疗剂量、是否化疗)、认知功能及生存期。应用简易智能量表(MMSE)进行认知功能测评,评分27-30分为正常,评分<27被认为存在认知功能障碍。所有数据应用SPSS20.0软件进行计算,生存资料通过Cox回归分析包括单变量及多变量分析。单变量分析中,P<0.05被认为有统计学意义;单因素分析P≤0.2者纳入多因素分析,如P<0.05,有统计学意义。结果:术后未接受放疗的老年脑胶质瘤患者的平均生存期仅为6.17±5.25月。病人术后接受了放疗但未达到足疗程及剂量,平均生存期为21.92±4.06月,而进行了术后标准剂量放疗的老年胶质瘤患者,平均生存期达32.08±22.5月。通过单因素分析,可以发现对比放疗组,未放疗组的一年死亡风险(95%CI)为20.52(4.46-94.41)(P<0.001),三年死亡风险为16.68(3.89-71.60)(P<0.001)。当随访至2014年5月(平均随访时间达到23.88月),15人(37.5%)已经因疾病死亡,25人(62.5%)存活,全部存活患者曾接受术后放疗。25人中,12人(48%)记忆力及理解力正常,13人(52.0%)出现了不同程度的记忆力减退、理解力下降,MMSE量表评分低于27分;认知缺陷的患者中,61.5%伴有系统性疾病(高血压病、糖尿病)。至2015年12月,只有8人存活,其中5人(62.5%)存在不同程度的认知功能缺陷,MMSE量表评分低于27分。小结:对于老年胶质瘤患者,术后放疗可以延长生存期,但同样可以加重认知功能障碍。当随访至近两年,患者认知功能障碍的比率超过一半。如果老年胶质瘤患者伴有高血压病、糖尿病,术后放疗出现认知功能障碍的几率增加。第二部分大鼠全脑放疗模型的建立及钙通道拮抗剂治疗放疗后认知功能障碍可行性的研究目的:建立大鼠单次全脑放疗模型,旨在建立一个简单有效的放疗后认知功能障碍的动物实验模型,探讨钙通道拮抗剂治疗放疗后认知功能障碍的可行性。方法:采用60只10周龄健康雄性Wistar大鼠,随机分为全脑放疗组(全脑放疗+生理盐水注射)、和对照组(接受麻醉+生理盐水注射),尼莫地平组(接受全脑放疗+尼莫地平治疗),每组20只大鼠,处理后继续饲养至7天(每组10只),12周(每组10只)后处死。全脑放疗组大鼠麻醉后,应用美国VARIAN IX 6MeV X线行单次全脑照射,照射剂量为30Gy,剂量率为300cGy/min,源皮距为100cm。其中对照组大鼠仅接受麻醉,尼莫地平组大鼠全脑放疗后每天一次腹部皮下注射尼莫地平注射液(0.5mg/kg),连续7天。饲养至12周的大鼠处死前行水迷宫实验测试大鼠认知能力。结果:所有大鼠整个实验过程全部存活,未发生麻醉过程死亡及放射过程中死亡。全脑照射第3、7天,全脑放疗组大鼠体重较对照组大鼠明显下降,P<0.05,有统计学差异,但1月后全脑放疗组与对照组大鼠体重无明显差异。照射后的大鼠头部照射区均出现毛发脱落,部分出现皮肤破损,且出现短暂精神状态差,活动少,进食差,继而出现兴奋、烦躁,攻击性较强,相互撕咬。Morris水迷宫实验测试大鼠认知功能。在学习能力训练的第一天,大鼠寻找平台的潜伏期分别为28.80±18.13s(对照组),35.76±20.94s(全脑放疗组),全脑放疗组大鼠寻找平台潜伏期时间明显增加,P=0.003。尼莫地平组大鼠潜伏期为30.48±17.83s,相比全脑放疗组大鼠,尼莫地平组大鼠寻找平台的潜伏期缩短,P=0.019,研究结果提示大鼠经全脑照射后学习能力下降,尼莫地平的应用能够改善大鼠的学习能力。在空间探索实验中,全脑放疗组大鼠在平台所在象限停留(24.33±1.17%)比对照组(29.63±2.25%)明显降低,P=0.001。而尼莫地平组大鼠平台象限停留(28.24±2.36%)较全脑放疗组有所增加,这些结果提示全脑放疗组大鼠的认知功能较对照组出现下降,如果给予尼莫地平治疗,大鼠的认知功能有所改善。Nissl染色显示全脑放疗组大鼠海马CA1区正常神经元数目较对照组正常神经元细胞数下降,尼莫地平组大鼠较全脑放疗组有所改善,但正常神经元数目仍低于对照组。小结:全脑照射后大鼠的海马区神经元数目减少提示大鼠经全脑放疗后海马区神经元受到影响。Morris水迷宫实验中证实大鼠经全脑照射后,学习和记忆能力下降。放疗后给予尼莫地平治疗,大鼠的学习记忆功能有所改善,且尼莫地平组大鼠海马CA1区神经元数目较全脑放疗组增多。可以初步判断,给予大鼠单次30Gy全脑放疗,可以建立简单有效的放疗后认知功能障碍的动物实验模型。在全脑放疗后应用钙通道拮抗剂尼莫地平对于放疗后认知功能障碍是可行且有效的。第三部分全脑放疗及钙通道拮抗剂对于大鼠海马区神经元的影响目的:探讨大鼠全脑放疗后及应用钙通道拮抗剂治疗后,大鼠海马CA1区神经元细胞形态及数目的变化以及齿状回神经元Caspase3的表达水平。方法:全脑照射后3月,水合氯醛麻醉大鼠,开胸经升主动脉灌流生理盐水和4%多聚甲醛(0~4℃),迅速取脑。冠状切取视交叉后1~4mm脑片,在4%多聚甲醛后固定24小时,梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片厚5um,每只鼠各取5张不连续切片脱蜡后进行组织学染色,尼氏染色后,光镜下计数双侧海马CA1区1mm区段内胞膜完整、胞核饱满、核仁清楚的锥体细胞数目,每侧海马CA1区各计数2个区段,取平均数,按神经元个数/mm2计算海马CA1区存活的神经元。另取每只大鼠取5张不连续石蜡切片进行免疫组化染色,进行Caspase3染色,检测海马齿状回区神经元细胞凋亡情况。结果:组织学染色显示,大鼠全脑照射后海马CA1区神经元细胞数目(85.3±22.9/mm~2)较对照组(183.2±27.6/mm~2)明显下降,细胞形态变化,胞体变小,部分细胞皱缩坏死,部分空泡变;海马齿状回(dentate gyrus,DG)神经元caspase3抗体表达水平增加。对比全脑放疗组,尼莫地平组大鼠CA1区神经元数目(128±19.5/mm~2)增加,DG区caspase3抗体表达下降,但对比对照组,尼莫地平组海马区神经元数量仍有明显下降,caspase3抗体表达上升。小结:脑放疗后海马区神经元细胞凋亡增加,从而导致神经元数目下降,影响了学习和记忆功能,导致放疗后认知功能障碍。应用钙通道拮抗剂尼莫地平可部分下调齿状回神经元caspase3表达水平,抑制放疗后海马区神经元细胞凋亡,从而改善全脑放疗后学习记忆功能受损情况。第四部分全脑放疗及钙通道拮抗剂对于海马区神经元再生及凋亡相关基因表达的影响目的:探讨全脑放疗后认知功能障碍可能相关基因的表达及钙通道拮抗剂对这些基因表达的影响。方法:经全脑照射后7天或者3月时,大鼠经水合氯醛麻醉后,迅速取脑,将鼠脑置于冰上,分离出两侧海马组织。液氮保存,按程序提取RNA,按步骤行PCR。7天组检测Bax-2、Bcl-2表达水平,计算凋亡相关因子Bax/Bcl-2比率,3月组检测APP、BDNF、GAP-43表达水平,以观察大鼠全脑照射及尼莫地平治疗后海马组织的早期及迟发变化。结果:聚合酶链反应(PCR)检测提示大鼠经全脑放疗后7天,对比对照组(0.39±0.14),全脑放疗后Bax/Bcl-2比率上调(0.62±0.16)。尼莫地平组大鼠海马区Bax/Bcl-2水平(0.47±0.10)较对照组亦出现上调,但明显低于全脑放疗组,三组之间均有统计学差异。全脑放疗后3月,放疗后大鼠海马区BDNF(5.13±0.46)、GAP-43(4.57±0.35)水平较对照组(6.93±0.61,5.89±1.20)下降,但放疗后应用尼莫地平组可以上调BDNF(7.18±1.00)表达水平,与单纯全脑放疗组有统计学差异。但尼莫地平组GAP-43(5.05±0.63)水平与全脑放疗组比较无统计学差异。经过全脑放疗后,淀粉样蛋白前体APP(Amyloid protein precursor)(4.74±1.43)较对照组(3.02±0.30)出现上调,但尼莫地平的应用(4.25±0.82)并不能逆转其水平上调。全脑放疗后3月,大鼠海马区BDNF、GAP-43水平较对照组下降,但放疗后应用尼莫地平组可以上调BDNF表达水平,接近对照组。而全脑放疗组、尼莫地平组APP较对照组上调,但二者之间无差异。小结:大鼠经过全脑放疗后,海马区Bax/Bcl-2比率出现上调,提示海马区神经元细胞凋亡增加;而放疗后应用尼莫地平,大鼠海马区Bax/Bcl-2比率较全脑放疗组明显下降,提示海马区神经元细胞凋亡减少。全脑放疗后3月,大鼠海马区BDNF、GAP-43较对照组下降,APP较对照组上调,但放疗后应用尼莫地平组可以上调BDNF表达水平,却不能明显改变GAP-43、APP表达水平。总之,尼莫地平抑制放疗后海马区神经元凋亡的机制可能与其抑制全脑放疗后Bax/Bcl-2上调,保护了海马区BDNF表达水平有关。结论:1.对于老年胶质瘤患者,术后放疗可以延长生存期,放疗后可能出现认知功能障碍。如伴有高血压病、糖尿病,术后放疗出现认知功能障碍的几率增加。2.大鼠单次全脑放疗30Gy,可以建立简单有效的放疗后认知功能障碍的动物实验模型。3.全脑照射后,大鼠的海马区CA1区神经元数目减少,齿状回神经元caspase3抗体表达显著增加,尼莫地平可抑制放疗后海马区神经元凋亡,改善全脑放疗后认知功能受损情况。4.尼莫地平抑制放疗后海马区神经元凋亡的机制可能与其抑制全脑放疗后Bax/Bcl-2上调,保护了BDNF表达水平有关。