【摘 要】
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【目的】研究电离辐射对心肌细胞死亡方式的影响及对线粒体的损伤作用,探讨坏死性凋亡是否参与了电离辐射引起的心肌细胞死亡及其与线粒体功能紊乱、氧化应激之间的相关性。【方法】用60Coγ射线单次照射H9C2大鼠心肌细胞,根据照射剂量进行分组,分为对照组（control组）和不同照射剂量组（5、10、20Gy组）。使用显微镜观察照射后各组心肌细胞形态变化;使用CCK8试剂盒检测照射后各组心肌细胞活性;利用
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【目的】研究电离辐射对心肌细胞死亡方式的影响及对线粒体的损伤作用,探讨坏死性凋亡是否参与了电离辐射引起的心肌细胞死亡及其与线粒体功能紊乱、氧化应激之间的相关性。【方法】用60Coγ射线单次照射H9C2大鼠心肌细胞,根据照射剂量进行分组,分为对照组（control组）和不同照射剂量组（5、10、20Gy组）。使用显微镜观察照射后各组心肌细胞形态变化;使用CCK8试剂盒检测照射后各组心肌细胞活性;利用APC-Annexin V/7AAD凋亡试剂盒检测照射后各组心肌细胞的凋亡情况;利用蛋白免疫印迹法检测各组心肌细胞凋亡（caspase3、PARP）和坏死性凋亡（RIPK1、RIPK3、MLKL）相关分子的蛋白表达情况;通过荧光探针H2DCF-DA标记,使用流式细胞术检测各组心肌细胞活性氧（ROS）产生情况;通过JC-1探针标记,使用激光共聚焦和流式细胞术的方法分别定性定量检测各组心肌细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的变化情况;通过钙黄绿素-AM探针标记,使用激光共聚焦和流式细胞术的方法分别定性定量检测各组心肌细胞线粒体膜通道孔（m PTP）的变化情况;使用蛋白免疫印迹法检测各组心肌细胞中线粒体酪氨酸磷酸化酶1（PTPMT1）分子的表达。使用坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1（Nec1）、Necrosulfonamide（NSA）以及氧化应激抑制剂N-acetylcysteine（NAC）分别处理H9C2大鼠心肌细胞,并施以20Gy剂量的60Coγ射线照射,根据是否给药及给药时间进行分组,分为单纯照射组（control组）和照射前8h给药组（BR组）与照射后给药组（AR组）,对各组心肌细胞进行凋亡、坏死性凋亡、线粒体损伤等相关表型的检测;使用q PCR,检测药物对照射后心肌细胞PTPMT1表达水平的影响。【结果】照射后,H9C2细胞形态发生变化,与未照射对照组相比,细胞数量减少,细胞皱缩、变小,延展性变差,漂浮细胞增多;与未照射对照组相比,照射后H9C2细胞活性降低,差异具有统计学意义（P<0.05）,且随着照射剂量的增加和时间的延长而逐渐降低;H9C2细胞死亡率随着照射剂量的增加而增加,差异具有统计学意义（P<0.01）;照射后H9C2细胞活性氧ROS产生增加（P<0.01）,照射组心肌细胞线粒体膜电位下降（P<0.01）,线粒体膜通道孔m PTP开放增加（P<0.01）,差异有统计学意义;坏死性凋亡抑制剂Nec-1和NSA可以提高照射后心肌细胞的活性,减少照射引起的心肌细胞死亡,并且对照射后心肌细胞的线粒体有保护作用,与对照组相比,给药组,无论是照射前给药还是照射后给药,均可使ROS活性氧产量下降,线粒体膜电位明显升髙,线粒体膜通道孔活性降低,差异具有统计学意义。氧化应激ROS抑制剂NAC不仅可以抑制照射后心肌细胞氧化应激水平,减少照射后心肌细胞中ROS的产生,同样可以发挥线粒体保护作用,提高线粒体膜电位,抑制m PTPT的活性。同时,与对照组相比,NAC给药组细胞活性增加,凋亡水平下降,细胞死亡率降低。照射后,H9C2细胞PTPMT1分子蛋白表达水平低于未照射组（P<0.01）,使用坏死性凋亡抑制剂Nec-1、NSA以及氧化应激抑制剂NAC可以显著提高照射后H9C2细胞中PTPMT1在核酸水平的表达（P<0.01）。【结论】电离辐射能导致大鼠心肌细胞H9C2增殖减慢、活性降低,发生凋亡和坏死性凋亡,线粒体功能损伤。坏死性凋亡抑制剂及氧化应激抑制剂对心肌细胞有保护作用,可改善照射引起的心肌细胞死亡以及线粒体损伤。PTPMT1可能参与了照射引起的心肌细胞死亡和线粒体损伤过程。
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