猪流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea virus,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）引起的急性、传染性胃肠道疾病,临床上可导致猪只严重腹泻、呕吐和脱水,并且对十日龄以内的仔猪致死率高达100%,给各国生猪养殖行业均造成了巨大经济损失和生产困难。猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种有囊膜包被的单股正链RNA病毒,属于α-冠状病毒;分为G1和G2两个亚型,最先在国外发现和流行是以PEDV CV777为代表的G1亚型毒株。然而自2010年10月以来,一种高致病性G2b变异株开始在中国爆发和流行,对中国的养猪行业造成了严重的损害。同时,传统的PEDV疫苗对现下流行的变异株已经不能起到有效的保护作用。因此在本研究中,将一株高致病性G2b亚型流行毒株PEDV CT,在Vero细胞中连续传代培养至120代,获得一株毒力减弱的PEDV P120。在传代过程中选择不同代次毒株P10、P64和P120进行研究和观察;通过对其在体外生物学特性研究、动物体安全性和免疫原性评估、全基因序列测序以及细胞转录组测序分析,四个方面来研究毒株致弱效果。结果显示,随着传代次数的升高毒株病毒滴度升高,且PEDV P120代次毒株毒价最高,感染细胞引起病变时间更短程度更加剧烈,说明该毒株具有较好的细胞适应性和病毒增殖能力。致病性实验表明,P120发病迟缓,临床症状轻微且排毒低持续时间短,恢复快,并且造成的组织病理学病变和肠道PEDV抗原分布均明显降低。同时P120仔猪的存活率为100%,P64为83.3%,P10为0%,说明P120代次毒株毒力确实有所降低,具有较好的安全性。免疫原性实验结果显示,PEDV P120可有效的激起动物体的免疫系统,产生较显著的Ig G抗体,提高细胞因子IL-4、IFN-γ水平以及有效的血清中和抗体,说明其具有较好的免疫原性。为了进一步深究其生物学特征改变和毒力减弱的原因,对PEDV P10、P64和P120代次毒株进行全基因测序和转录组测序。全基因测序结果分析表明,P120有14个碱基突变,导致13个氨基酸突变,其中S1和S2有2个氨基酸突变,P64有10个碱基突变,与P10相比有9个氨基酸突变。有趣的是,P120和P64都存在ORF1ab,M,N,E氨基酸的突变和缺失。这些结果表明,PEDV的衰减可能是通过多种分子机制发生的,需要通过反向遗传技术进行进一步验证和研究。利用Hi Seq平台对高低代次毒株转录组m RNA表达谱进行数据分析,结果显示,感染的前期,后期和中期分别有51、214、263个显著差异表达基因。通过比对到GO和KEGG数据库,分析结果表明:功能注释中差异表达基因主要集中在生物学过程组分中细胞进程和分子功能,注释到的通路主要集中在信号传导通路;富集分析结果显示差异表达基因同样主要富集在生物学进程的Term以及TNF信号通路等病毒和免疫相关的通路中。荧光定量验证各时期差异表达基因发现与测序结果相符,为揭示其致弱机理提供思路和方向。总的来说,本研究通过细胞传代获得一株毒力减弱的弱毒株,为弱毒疫苗的制备提供丰富的理论支持和方法。