【摘 要】
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猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种新发现的肠道冠状病毒,是一种有包膜的单股正链RNA病毒,属于冠状病毒科α冠状病毒属。该冠状病毒于2017年1月在中国广东首次被发现,并在仔猪中大规模爆发,造成严重的腹泻,脱水,呕吐,刚出生仔猪死亡率高达90%。自2017年华南猪场爆发母猪和仔猪腹泻病以来,SADS-CoV导致接近25000头仔猪死亡,给养猪业造成了一定的经济损失,鉴于SADS-Co
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猪急性腹泻综合征冠状病毒（SADS-CoV）是一种新发现的肠道冠状病毒,是一种有包膜的单股正链RNA病毒,属于冠状病毒科α冠状病毒属。该冠状病毒于2017年1月在中国广东首次被发现,并在仔猪中大规模爆发,造成严重的腹泻,脱水,呕吐,刚出生仔猪死亡率高达90%。自2017年华南猪场爆发母猪和仔猪腹泻病以来,SADS-CoV导致接近25000头仔猪死亡,给养猪业造成了一定的经济损失,鉴于SADS-CoV对养猪业造成的严重危害,深入研究其致病机制迫在眉睫。众所周知,天然免疫系统中干扰素（IFN-α/β）的产生对于宿主的抗病毒免疫应答至关重要,这是抵御大部分病源微生物侵入细胞的最前线。因此,许多病毒也进化出不同的策略来逃避宿主的天然免疫。作为一种新发冠状病毒,近期的研究报道都是主要集中在临床诊断、分子流行病学、进化和动物模型等方面,但SADS-CoV与宿主天然免疫应答之间的相互作用尚不清楚。而研究SADS-CoV如何调控宿主天然免疫,将有利于我们更好的理解SADS-CoV的发病机理和致病机制。为了探究SADS-CoV以及其核衣壳蛋白逃避宿主天然免疫的机制,本文分别研究感染SADS-CoV以及过表达SADS-CoV结构蛋白N对IFN-β产生的影响,并阐明它们逃避天然免疫的机制,具体研究内容如下:（1）SADS-CoV感染抑制IFN-β产生的机制研究本研究利用猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）作为SADS-CoV体外感染的模型研究SADS-CoV逃避天然免疫的机制。本研究发现SADS-CoV感染IPEC-J2细胞不诱导IFN-β产生,并且能抑制Poly（I:C）以及SEV诱导的IFN-β的产生,随后Western blot以及IFA显示SADS-CoV感染也抑制IRF3和NF-κB的磷酸化和核易位。进一步的双荧光素酶结果显示SADS-CoV感染为未能阻断TBK1、IKKε、IRF3所诱导的IFN-β启动子的活性,但能抑制由IPS-1以及RIG-I诱导的IFN-β启动子的活性,说明SADS-CoV通过靶向IPS-1来抑制IFN-β的产生。（2）SADS-CoV结构蛋白N抑制IFN-β产生的机制研究为了探究SADS-CoV所编码的结构蛋白对于IFN-β产生的影响,本研究构建了SADS-CoV所编码的四个结构蛋白真核表达质粒,并以HEK-293T细胞作为细胞模型,确定出SADS-CoV核衣壳蛋白（nucleocapsid protein）能显著抑制SEV诱导IFN-β的产生,同时也能抑制由SEV诱导的IRF3的磷酸化和核易位。随后双荧光素酶实验表明N蛋白可以抑制由TBK1以及其上游的关键信号分子（TRAF3,IPS-1,RIG-I,MDA5）诱导的IFN-β启动子活性,提示着TBK1可能是N蛋白的靶分子,而后续免疫共沉淀实验以及间接免疫荧光结果则表明N蛋白与TBK1存在物理相互作用,进一步的免疫共沉淀结果显示N蛋白抑制IPS-1与TBK1之间的互作,而Western blot结果显示N蛋白可以抑制由TBK1诱导TBK1的磷酸化,这些结果表明N蛋白阻断IPS-1向下游TBK1信号传递。而IPS-1需通过招募预先关联的TBK1-TRAFs复合物从而激活TBK1,后续免疫共沉淀分析表明N蛋白干扰了TBK1与TRAF3之间的关联,这些结果表明N蛋白通过干扰TBK1与TRAF3之间的互做导致IPS-1无法招募TBK1,而使TBK1激活失败,最终阻断IFN-β的产生。总的来说,本研究揭示了SADS-CoV以及其核衣壳蛋白采用了独特的策略来逃避天然免疫,同时也为冠状病毒以及其结构蛋白N逃避先天免疫提供了新的见解。
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