传染性法氏囊病病毒浙江分离株(TL2004)全基因组的克隆及生物信息学分析

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传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的急性接触性传染病,是危害世界养禽业的主要传染病之一。IBDV主要侵害雏鸡的中枢免疫器官一法氏囊,导致免疫抑制。用弱毒苗和灭活苗免疫鸡群是目前防治IBD的主要方法,但随着IBDV变异株与超强毒株的出现,免疫失败常有发生。从浙江省杭州某IBDV疫苗免疫后鸡场暴发疑似传染性法氏囊病的鸡群中采集法氏囊病料,分离病毒,经琼脂免疫扩散试验、间接ELISA、鸡胚回归试验和电镜观察等证实所分离的这株(TL2004)野毒是传染性法氏囊病病毒,该毒株在抗原性和毒力上都表现出一些新特征,需要进一步在分子水平进行研究。以传染IBDV TL2004株(野毒株)基因组dsRNA为模板,采用Long-accurate RT-PCR(LA-PCR)一步法扩增了病毒的基因组A节段和B节段的全长cDNA。A节段全长3260nt,包括5’、3’端的非编码区(NCR)和2个部分重叠的开放阅读框(ORFA1和ORFA2)。B节段全长2827nt,包括5’、3’端的非编码区(NCR)和1个开放性的阅读框(ORF)。二级结构预测表明,A节段和B节段的5’、3’端非编码区均存在一个大型的发夹环结构。ORFA1和ORFA2分别编码1012个氨基酸的VP2-VP4-VP3和145个氨基酸VP5,B节段ORF编码一个879个氨基酸的VP1。在氨基酸水平上,VP1、VP2、VP3、VP4和VP5与参比Ⅰ毒株的同源性分别为94.4%~99.3%、93.4%~99.6%、94.2%~99.2%、95.9%~99.6%、94.5%~99.3%。TL2004共有36个氨基酸的替代,其中大部分位于VP2和VP1。VP2的第2个小的亲水区内279位S替代了N、290位M替代了L,这两个突变可能与IBDV的抗原性漂变有关。VP1具有超强毒株所特有8个氨基酸,并且518位的R和525位的D为该毒株所独有。同源性分析提示,TL2004的基因组A节段与欧洲的CEF94、中国的JD1、HZ2和NB亲缘关系较近,基因组B节段却与超强毒株BD3/99和UK661的亲缘关系较近。以上分析提示,TL2004可能是由于IBDV超强毒株的基因组B节段和弱毒株的基因组A节段在自然界中进行基因重配后产生的新毒株。本研究用一步法直接从鸡胚尿囊液中快速克隆了IBDV浙江分离株(TL2004)基因组全长cDNA,对其基因组结构、抗原、毒力变异的分子基础进行分析,这为全面了解我省IBDV毒株的分子特征,进行大规模的分子流行病学调查等具有意义。
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