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急性肺损伤(acute lung injury,ALI)为肺炎及严重脓毒症等患者常见并发症之一,其恶化阶段即为急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS),预后差,病死率高,迄今尚无安全有效的早期干预药物,亟待研究进一步解决。肺血管内皮细胞是ALI中最为重要的效应细胞受损靶细胞,也是ALI药物干预的重要靶点。课题组前期构建了肺血管内皮细胞靶向的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)单抗辛伐他汀纳米脂质载体(ICAM-NLC),具有一定早期ALI抗炎能力,但总体效果不甚理想,有待进一步提高。为此,本论文通过纳米基因转染技术,以阳离子鱼精蛋白(protamine,Pro)为 DNA 密接材料,血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)基因为基因药物,在前期制备ICAM-NLC纳米载体的基础上,通过静电吸附法继续构建ICAM-1单抗辛伐他汀纳米脂质载体/鱼精蛋白/Ang-1基因三元复合物(ICAM-NLC/Pro/Ang),即Ang-1基因与辛伐他汀纳米共传递系统,将Ang-1基因与辛伐他汀共同靶向输送至ALI肺血管内皮细胞,以期通过基因治疗与化学治疗联合用药的方式,进一步提高ALI的早期干预能力。采用静电吸附法构建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物,形状呈类球状,粒径随ICAM-NLC质量比例的增高而增大,当ICAM-NLC/Pro/Ang质量比例增加至30:4:1时,三元复合物粒径达到最大约为351.7nm,Zeta电位为12.1mV。凝胶阻滞试验表明,当ICAM-NLC对DNA的比例在10到30之间时,三元复合物中的DNA均可以被完全阻滞,体现了所制备的三元复合物对Ang-1基因的良好保护作用。MTT法细胞毒性试验结果显示,三元复合物与EAhy926细胞共同孵育48h后,细胞存活率高达90%以上,表明三元复合物较低的细胞毒性,是潜在的ALI基因治疗与化学治疗联合用药的纳米载药系统。以脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导人血管内皮细胞株EAhy926细胞24h,构建ALI血管内皮细胞模型。研究结果显示,与正常EAhy926细胞相比,经LPS活化后,流式细胞仪所检测到的表达ICAM-1粘附分子的细胞比例从17.2%提高至50.0%,说明成功构建ALI血管内皮细胞模型。用标记了罗丹明(ROX)染料的DNA代替目的基因Ang-1,制备ROX标记的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元复合物,考察三元复合物在EAhy926细胞内的转运。细胞摄取研究表明,随着ICAM-NLC比例提高,三元复合物的细胞摄取程度降低,考虑与三元复合物的粒径增大有关;与非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,经ICAM-1单抗修饰的ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA 三元复 合物细 胞转运 能力明 显提升,表明 ICAM-NLC/Pro/ROX-DNA三元复合物对LPS活化后的EAhy926经ICAM-1单抗介导的细胞靶向特性。制备ROX和异硫氰基荧光素(FITC)标记的ICAM-NLC/Pro/DNA三元复合物,考察三元复合物中基因(ROX标记)与NLC(FITC标记)的细胞摄取共定位,结果表明三元复合物与EAhy926细胞孵育6h后,NLC主要分布在细胞质中,而DNA则部分转运到细胞核,说明以NLC为基础的纳米给药系统具有潜在的DNA核导入能力。以ICAM-1单抗阻断细胞表面的ICAM-1粘附分子后,流式细胞仪定量检测显示,摄取ICAM-NLC/Pro/DNA(30:4:1,w/w/w)三元复合物的EAhy926细胞样本MFIs从32降低到了 23,表明经细胞粘附分子(cell adhesion molecule,CAM)介导的内吞机制是三元复合物细胞转运的主要途径之一。采用DiR荧光染料标记ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元复合物,以LPS诱导构建ALI Balb/c小鼠模型,三元复合物尾静脉注射给药6h后,小鼠体内分布显示肺脏荧光强度最强,证实了 ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物的肺组织靶向特征。以绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP为报告基因(EGFP)替代Ang-1基因,制备绿色荧光蛋白标记的ICAM-NLC/Pro/EGFP三元复合物,考察三元复合物在EAhy926模型细胞的基因转染效率;研究结果显示:三元复合物在EAhy926模型细胞内均具有较强的绿色荧光蛋白表达能力(20%以上);随着ICAM-NLC与DNA的重量比从10/1增加到30/1,三元复合物的细胞转染效率呈轻微下降趋势,这可能与NLC比例较高的三元复合物粒径较大,从而更难被细胞摄取有关;与非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,ICAM-NLC/Pro/EGFP组的基因转染效率显著提高。考虑到辛伐他汀给药剂量及粒径较大纳米粒利于肺组织靶向的需要,选择ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)作为后续Ang-1蛋白表达及动物药效学研究。以Western Blot法测定三元复合物在ALI模型细胞及模型动物的Ang-1蛋白表达情况。结果显示:与EAhy926细胞孵育48h后,ICAM-NLC/Pro/Ang组细胞内Ang-1蛋白表达含量显著高于静息细胞组、LPS活化细胞组以及ICAM-NLC细胞组(P<0.001);而ICAM-NLC/Pro/Ang组Ang-1蛋白表达又显著高于非ICAM-1单抗修饰三元复合物组(P<0.05),可能是基于ICAM-NLC/Pro/Ang对高表达ICAM-1 EAhy926细胞的靶向性。ALI模型小鼠给予ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物48h后,肺组织Ang-1蛋白的表达趋势与EAhy926细胞的表达趋势基本一致。表明ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)三元复合物具有提高ALI模型细胞以及模型小鼠中Ang-1蛋白表达水平的作用,具有潜在的改善ALI血管内皮损伤的作用。选择Balb/c小鼠,气管滴注LPS构建ALI小鼠模型,进行三元复合物对ALI小鼠模型保护作用的药效学研究。研究发现,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)给药24h、48h后,与ICAM-NLC组、非ICAM-1单抗修饰三元复合物组相比,具有显著改善小鼠肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)等炎症因子水平、炎症细胞总计数以及多形核白细胞(polymorphonuclear leukocytes,PMNs)占BALF中总细胞比例的作用,并且48h的炎症因子水平及炎症细胞水平与24h较为相似;HE染色组织病理切片也提示,ICAM-NLC/Pro/Ang(30:4:1,w/w/w)对ALI模型小鼠病理肺组织的炎症细胞浸润、肺泡隔增厚等病理表征均具有最显著的改善作用。上述结果表明,本研究所构建的ICAM-NLC/Pro/Ang三元复合物,即Ang-1基因与辛伐他汀纳米共传递系统,可有效将Ang-1基因与辛伐他汀共同靶向输送至ALI肺组织,通过基因治疗与化学治疗联合用药的方式,可改善ALI早期的炎症水平,进一步提高了 ALI的早期干预能力,具有潜在的临床应用价值。