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目的:TLR7在病毒感染中起重要作用,然而,它在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,Mtb)感染巨噬细胞中的表达、作用及机制目前尚不清楚。本课题探讨TLR7对RAW 264.7巨噬细胞内Mtb的存活影响及其作用机制。方法:通过RT-PCR和Western blot检测Mtb感染RAW 264.7巨噬细胞后TLR7m RNA和蛋白的表达。调控TLR7对Mtb的影响:上调TLR7实验分组:感染对照组、饥饿(自噬阳性)对照组、异烟肼阳性对照组、ss RNA组;下调TLR7实验分组:感染对照组、scramble control组、si RNA组;细胞处理后行抗酸染色,并计数100个巨噬细胞中Mtb的数量。调控TLR7对细胞活力的影响:细胞按上述分组处理后,加入细胞活力检测试剂(Cell Counting Kit-8,CCK8)37℃孵育5 h,用酶标仪检测450 nm处的吸光度。透射电子显微镜(Transmission electron microscopy,TEM)观察细胞超微结构:上调TLR7实验分组:正常对照组、感染对照组、饥饿(自噬阳性)对照组、ss RNA组;下调TLR7实验分组:正常对照组、感染对照组、si RNA组;细胞经胰酶消化,2 000 rpm离心15min,PBS清洗3遍,加入3%戊二醛4℃过夜固定后,行脱水、包埋、切片及染色后用TEM观察。细胞按上步分组处理后,用Western blot方法检测自噬微管相关蛋白轻链3(Microtubule-associated protein light chain 3,LC3)的表达。结果:(1)PCR结果显示,与正常细胞(0.037±0.001)相比,TLR7 m RNA表达量在Mtb感染巨噬细胞中6 h(0.092±0.015)、12 h(0.36±0.001)和24 h(0.371±0.019)均显著升高(P<0.001);Western blot结果显示,与正常细胞(0.019±0.002)相比,TLR7蛋白表达量在Mtb感染巨噬细胞6 h(0.046±0.001)无差异(P>0.05),但在12 h(0.282±0.018)和24 h(0.303±0.033)均显著升高(P<0.001)。(2)调控TLR7对Mtb的影响:上调TLR7对Mtb的影响:ss RNA组Mtb数量(37.67±3.79%)明显少于感染对照组(127.67±6.66%)(P<0.001)和饥饿(自噬阳性)对照组(72±8.19%)(P<0.05),与异烟肼阳性对照组(32.67±3.79%)无显著差异(P>0.05);下调TLR7对Mtb的影响:si RNA组Mtb数量(133.00±3.61%)与感染对照组(136.33±2.52%)无差异(P>0.05),但有下降趋势。(3)调控TLR7对细胞活力的影响:上调TLR7对细胞活力的影响:ss RNA组与正常对照组相比(100%),细胞活力在12 h(126.69±5.33%)、24 h(117.09±0.10%)和48 h(143.08±1.16%)均显著升高(P<0.001);与感染对照组(12 h,124.19±2.50%;24 h,112.42±1.07%;48 h,135.01±0.71%)相比在12 h无显著差异(P>0.05),24 h(P<0.05)和48 h(P≤0.001)均显著升高;与饥饿(自噬阳性)对照组相比(12 h,112.643±3.774%;24 h,93.713±0.709%;48 h,58.61±0.636%)在12 h(P<0.05)、24 h和48 h均显著升高(P<0.001);与异烟肼阳性对照组(12 h,121.95±4.137%;24 h,125.3±0.708%;48 h,158.26±0.565%)相比在12 h无差异(P>0.05),24 h和48 h显著降低(P<0.001)。下调TLR7对细胞活力的影响:与正常对照组(100%)和感染对照组(12 h,124.19±2.50%;24 h,112.42±1.07%;48 h,135.01±0.71%)相比,si RNA组细胞活力在12 h(65.23±2.46%)、24 h(58.35±0.21%)和48 h(21.74±0.17%)均显著降低(P<0.001)。(4)TEM观察细胞超微结构:上调TLR7:正常对照细胞线粒体清楚,胞浆内可见1-2个自噬体;感染对照细胞线粒体不清楚,核染色质固缩、边集;饥饿(自噬阳性)对照细胞线粒体基质深染,胞质内有多个自噬体;ss RNA组细胞线粒体相对清晰,胞浆内自噬体显著增多;下调TLR7:si RNA组细胞胞质内未见自噬体,粗面内质网扩张,核周边间隙增宽。(5)TLR7诱导LC3-II形成:ss RNA能显著诱导LC3-II蛋白表达(3.56±0.091 vs.0.692±0.04,ss RNA组vs.感染对照组)(P<0.001),然而,TLR7经si RNA下调后,LC3-II表达量(0.946±0.055)较感染对照组(2.400±0.029)显著降低(P<0.001)。结论:(1)TLR7在Mtb感染的RAW 264.7巨噬细胞中表达量升高,而且有时间依赖性。(2)TLR7可通过调控自噬途径影响Mtb在巨噬细胞中的存活。(3)TLR7可作为TB的治疗靶点。