乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，占女性所有癌症相关死亡率的第二位。继手术、放疗、化疗和内分泌治疗外，分子靶向药物的应用成为攻克肿瘤治疗的又一手段。抗Her-2单克隆抗体Herceptin是最常用的乳腺癌分子靶向药物，但仅对Her-2过表达者发挥作用，而Her-2过表达者仅占乳腺癌患者的30％，且大部分患者在用药一年内发生耐药。因此临床上急需找到乳腺癌治疗新的靶点。近年来发现，脂肪酸代谢和机体的能量平衡与各种肿瘤的发生、发展密切相关，能量链中的核心分子脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase，FAS）作为一种新的代谢性癌基因成为研究的热点。FAS在正常组织中低表达或不表达，但在绝大部分人类恶性肿瘤及癌前病变组织中过表达并具有高活性，是肿瘤细胞最普遍的分子变化之一。FAS在侵袭型乳腺癌组织中高表达，并与其恶性表型和较差的临床预后密切相关，是独立的影响临床预后因素。因此，FAS成为肿瘤治疗的一个新的靶点。本研究将FAS启动子、单纯疱疹病毒胸苷激酶（herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK）基因和腺病毒结合到一起，设计了一种新型靶向乳腺癌基因治疗方法。该方法克服了传统基因治疗转染效率低、靶向性差以及靶向抗原表达差异大的缺点，有望在临床肿瘤治疗中得以广泛应用。 目的：建立一种新型安全有效的乳腺癌基因治疗体系，并对其靶向乳腺癌细胞的细胞毒作用进行评估，为其临床应用提供依据。 方法 ①利用western blot 和间接免疫荧光法检测FAS 在包括乳腺癌细胞系在内的7种肿瘤细胞中的表达。 ②两步法PCR 克隆具有关键转录调控元件的FAS 启动子、粘蛋白4（mucin4，MUC4）启动子片段。从pGEM-Teasy-cerbB2 和pGL2-basic-MK 载体中获得cerbB2 启动子以及中期因子（midkine，MK）启动子片段。 ③利用基因重组的方法构建含肿瘤特异性启动子FAS、MUC4、cerbB2 以及MK 的重组荧光素酶表达载体，并检测它们在肿瘤细胞中的转录活性。 ④PCR 法克隆含polyA 尾的HSV-TK 全长cDNA，构建FAS 启动子驱动的HSV-TK 重组腺病毒穿梭载体pshuttle-FAS-TK，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1 以电穿孔法在BJ5183 菌中同源重组，获得重组腺病毒载体rAdeno-FAS-TK。 ⑤将线性化的rAdeno-FAS-TK 以脂质体法转染QBI-293A 细胞，制备和纯化复制缺陷型重组腺病毒Ad-FAS-TK。 ⑥免疫荧光法和MTT 法检测不同MOI 的Ad-GFP 对乳腺癌细胞SK-Br3 的感染能力和存活影响。MTT 法和平板克隆形成实验检测Ad-FAS-TK 联合前体药物GCV 对三种乳腺癌细胞的靶向细胞毒作用。 ⑦流式细胞法和TUNEL 法评估Ad-FAS-TK/GCV 对SK-Br3 乳腺癌细胞的诱导凋亡作用。 结果 ①Western blot 和间接免疫荧光结果表明，FAS 在SK-Br3 和SGC-7901 细胞系中表达最高，在MCF-7、A549 以及HepG2 细胞系中中等表达，在Hela和MDA-MB-231 细胞系中表达较低，而在正常成纤维细胞NIH3T3 细胞中不表达。FAS 蛋白主要定位于胞质中。 ②以人基因组DNA 为模板，经两步法PCR 扩增出约680bp 的FAS 启动子片段和约625bp 的MUC4 启动子片段。基因重组法获得约258bp 的cerbB2 启动子片段和约600bp 的MK 启动子片段。 ③构建pGL3-FAS、pGL3-MUC4、pGL3-cerbB2 和pGL3-MK 荧光素酶表达载体。荧光素酶检测结果显示，pGL3-FAS 在受检测的各肿瘤细胞系中均具有较高的转录活性，而在正常成纤维细胞NIH3T3 中，几乎无转录活性。MUC4启动子与FAS 启动子相比，在各肿瘤细胞间的转录活性差异较大。FAS 启动子较MUC4 启动子更适合作为广谱肿瘤特异性启动子。FAS 启动子在人乳腺癌细胞系SK-Br3、MCF-7 以及MDA-MB-231 中具有强转录活性，对于Her-2表达阳性或阴性的细胞均具有高转录活性，较cerbB2 启动子作用范围更为广泛，较MK 启动子转录活性更高。 ④构建含完整表达框的重组腺病毒穿梭载体pshuttle-FAS-TK。Pshuttle-FAS-TK与pAdeasy-1 同源重组，获得重组腺病毒载体rAdeno-FAS-TK。线性化的rAdeno-FAS-TK在QBI-293A细胞中包装、扩增、纯化、浓缩，经TCID50 法测定，获得滴度约为1×1010pfu/mL的复制缺陷型重组腺病毒Ad-FAS-TK。 ⑤ Ad-GFP 在MOI 在50-100 时，感染乳腺癌细胞SK-Br3 细胞的能力最强，且对细胞活性没有太大影响。Ad-FAS-TK/GCV 可诱导三种乳腺癌细胞明显的细胞毒作用，而正常成纤维细胞NIH3T3 则不敏感。在较高的病毒MOI 条件下，三种乳腺癌细胞对GCV 诱导的细胞毒作用呈剂量依赖型增加。但是在较低的病毒MOI 条件下，随着GCV 浓度的增加，三种乳腺癌细胞对GCV诱导的细胞毒作用逐渐达到一个平台。在相同GCV 条件下，随着MOI 的增加，三种乳腺癌细胞的存活率呈剂量依赖型降低。在三种乳腺癌细胞中，SK-Br3 细胞的细胞毒作用最明显。平板克隆形成实验结果显示，Ad-FAS-TK/GCV 处理后的三种乳腺癌细胞的克隆形成能力几乎被完全阻断，而对正常成纤维细胞NIH3T3 的克隆形成能力几乎没有影响。 ⑥DeadEnd 荧光法TUNEL检测显示， TM 在Ad-FAS-TK（MOI 10）/GCV（1μg/mL）作用48hr时即可观察到SK-Br3 细胞凋亡。流式细胞法检测出明显的凋亡峰，细胞周期也有所改变，与无任何处理的对照相比，G2-M期亚群减少，S期亚群增加。 结论 ①FAS 蛋白在肿瘤细胞中的表达与Her-2/neu 的表达水平密切相关。 ②FAS 启动子具有高效特异性靶向多种肿瘤细胞的特点，可以作为肿瘤靶向的调控元素用于恶性肿瘤的靶向基因治疗。 ③成功构建FAS 启动子驱动的HSV-TK 重组复制缺陷型腺病毒。 ④重组腺病毒Ad-FAS-TK 联合GCV 对乳腺癌细胞具有靶向细胞毒作用，且这种细胞毒作用至少部分通过诱导细胞凋亡的途径而实现。 综上所述，成功建立FAS 启动子驱动的HSV-TK 腺病毒靶向基因治疗方法，并在体外试验中证实该方法可高效、安全的靶向乳腺癌细胞发挥细胞毒作用，为乳腺癌以及其它肿瘤的基因治疗提供新的途径，具有广阔的临床应用前景。