论文部分内容阅读
大口黑鲈是遗传研究和基因信息比较缺乏的物种。目前大口黑鲈可利用的有效标记数量有限,建立表达序列标签(EST)数据库,为SSR和SNP的开发提供了新的途径。本研究应用高通量罗氏454测序技术对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种进行转录组测序并建立ESTs数据库,并以文库为基础进行大口黑鲈SSR和SNP的筛选及生长性状的关联分析,主要研究内容和结果如下:1、大口黑鲈两个亚种EST数据库的构建和分析应用新一代高通量测序技术Roche454对大口黑鲈北方亚种(M. salmoidessalmoides)和佛罗里达亚种(M. salmoides floridanus)进行转录组测序并建立ESTs数据库,结果得到北方亚种ESTs序列468671条,佛罗里达亚种ESTs序列332322条,两亚种ESTs序列的平均长度分别为306.5bp和304.4bp。将得到的高质量序列进行拼接,大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种共得到contig序列总数分别为42056条和35743条,平均长度分别是612.6bp和588.2bp。将大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种的数据库合并,通过与蛋白数据库比对后,共78938条EST序列被注释,根据Gene Ontology(GO)信息,对序列按照分子功能、细胞组成、生物学过程进行分类。通过对大口黑鲈合并的EST库信息进行大通量SSR和SNP位点的发掘,发现了含SSRs和SNPs的序列分别是25469和8547条。从EST数据库中随机选取75条contigs进行北方亚种和佛罗里达亚种的序列比较,结果表明两个亚种EST序列同源性为99.2%。2、大口黑鲈EST-SSR标记的开发选取133条SSRs序列并设计引物,其中15对能够扩增出带型清晰且有多态性的谱带。用这15对引物分析大口黑鲈微卫星的多态性,结果表明:每个位点检测到的等位基因数为2-5个,平均等位基因是2.533个,观测杂合度(Ho)和期望杂合度(He)的范围分别为0.150-0.857(平均0.480)和0.262-0.739(平均0.550),平均多态信息含量(PIC)的范围为0.261-0.740(平均0.384)。Hardy-Weinberg平衡的卡方检验结果表明15个位点中只有一个位点(Contig44566)严重偏离了平衡。3、大口黑鲈SNP的筛选及载脂蛋白部分序列上SNP多态性与生长相关的分析根据大口黑鲈EST库中的载脂蛋白、激活素、锌指蛋白等生长代谢基因的10个片段设计引物扩增,结果共得到了14个SNP位点。为进一步研究其中载脂蛋白(载脂蛋白A1、载脂蛋白A4和载脂蛋白C1)基因上的SNP位点,将其在另外一个群体中进行验证,结果表明大口黑鲈载脂蛋白A1基因上有1个颠换SNP位点:A+489C;载脂蛋白A4上筛到1个转换SNP位点:A+633T;载脂蛋白C1上筛到2个颠换SNP位点:A+24G和A+75C。采用SnapShot的方法分别对同一群体的159尾大口黑鲈的这4个位点进行检测和分型,统计基因型频率,并利用一般线性模型分析4个SNPs位点与大口黑鲈体质量、全长等重要生长性状的相关性,分析结果表明:在载脂蛋白A1基因上A+489C位点的不同基因型与体重和高之间存在显著的相关性(P<0.05)。载脂蛋白A4和载脂蛋白C1基因上的A+633T、A+24G和A+75C位点的不同的基因型与鱼的体重、体高和全长的相关性显著(P<0.05)。