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【目的】1.探讨乳腺癌细胞外泌体对乳腺癌细胞TAM（tamoxifen,他莫昔芬）耐药的影响;2.探讨miR-9-5p影响乳腺癌细胞TAM耐药的机制。【方法】在前期工作中,我们利用基于微阵列的生物信息学分析,筛选出乳腺癌差异表达基因ADIPOQ（Adiponectin,脂联素）及其调节性miRNA-9-5p（miR-9-5p）以用于后续实验。制备MCF-7/TAM（tamoxifen resistant MCF-7 cells,TAM耐药的MCF-7细胞系）和非药物敏感的MCF-7细胞系,然后分离出外泌体。与TAM共培养后,检测外泌体处理的MCF-7细胞凋亡率。为了验证miR-9-5p和ADIPOQ在体外和体内对MCF-7细胞TAM抵抗的影响,我们将miR-9-5p模拟物及抑制剂分别导入MCF-7细胞及MCF-7/TAM细胞外泌体,将敏感细胞MCF-7细胞与各组外泌体共培养,采用RT-PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,逆转录聚合酶链反应）检测miR-9-5p在MCF-7和MCF-7/TAM细胞株中的表达情况、CCK-8（Cell counting kit-8 assay,细胞技术试剂盒8测定）检测转染miR-9-5p模拟物和miR-9-5p抑制剂各组细胞活力及IC50（half maximal inhibitory concentration,半数最大抑菌浓度）值、流式细胞术检测转染细胞的凋亡,验证miR-9-5p是否可改变乳腺癌细胞的TAM耐药性。采用RT-PCR检测miR-9-5p在各组外泌体中的表达以及经各组外泌体共培养后的MCF-7受体细胞中miR-9-5p和ADIPOQ mRNA表达、Wb（Western blot,蛋白质印迹法）检测ADIPOQ蛋白在各组细胞中的表达,验证外泌体能有效携带miR-9-5p影响乳腺癌细胞中ADIPOQ的表达。进一步采用CCK-8检测经各组外泌体共培养后的MCF-7受体细胞活力及IC50值、流式细胞仪检测经各组外泌体共培养后的MCF-7受体细胞凋亡情况,验证外泌体中miR-9-5p对乳腺癌细胞耐药性的影响。【结果】通过透射电子显微镜观察、纳米颗粒跟踪分析仪（Nano Sight NS300）分析提取的外泌体的粒径以及WB实验在外泌体中验证标记蛋白证实,本实验分离外泌体成功。MCF-7和耐药株MCF-7/TAM细胞的外泌体（被PKH67染料标记）与MCF-7细胞共培养结果提示耐药细胞的外泌体能够被敏感细胞摄取。PBS,MCF-7外泌体及MCF-7/TAM-exo处理MCF-7细胞后,CCK-8实验结果显示,在不同他莫昔酚浓度培养液处理下,与对照组PBS和MCF-7-exo组相比,MCF-7/TAM-exo共培养后敏感细胞株MCF-7细胞对他莫昔酚的细胞活力显著增强,IC50明显升高（P＜0.05）。经三组外泌体共育的MCF7的细胞周期分布以及10u M他莫昔酚处理后的细胞凋亡率进行分析,三组10u M他莫昔酚处理后的细胞凋亡率分别为:PBS组28.33±3.21,MCF-7-exo组25.02±3.07,MCF-7/TAM-exo组9.81±1.09。与对照组PBS+MCF和MCF-7-exo组比MCF-7/TAM-exo共培养后MCF-7细胞G1期细胞增加,S期细胞减少（P＜0.05）。细胞凋亡率则显著减少（P＜0.05）。PCR检测miR-9-5p在MCF-7和MCF-7/TAM细胞株中的表达分别为0.99±0.10和2.39±0.20,在耐药株MCF-7/TAM中miR-9-5p的表达显著提高（P＜0.05）。转染miR-9-5p模拟物和抑制剂以及CCK-8实验结果显示各组细胞IC50（μM）值分别为MCF-7+NC-mimic组0.20±0.02,MCF-7+miR-9-5p mimic组5.71±0.40,MCF-7/TAM+NC-inhibitor组5.41±0.28,MCF-7/TAM+miR-9-5p inhibitor组0.21±0.03。MCF-7细胞株中瞬时转染miR-9-5p模拟物后,与模拟物空白对照组作对照,细胞抑制率显著下降（P＜0.05）,IC50增高（P＜0.05）,而且抑制率呈剂量效应关系。同样,瞬时转染miR-9-5p抑制剂后,与抑制剂空白组作对照比,细胞抑制率显著上升（P＜0.05）,IC50降低（P＜0.05）,并且抑制率也呈剂量效应关系。采用流式细胞术检测转染细胞的凋亡,结果显示:在MCF-7细胞株中瞬时转染miR-9-5p模拟物后,与模拟物空白组对照,细胞的凋亡率显著下降,瞬时转染miR-9-5p抑制剂后,与抑制剂空白组对照比,细胞凋亡率显著上升。转染miR-9-5p模拟物MCF-7细胞的外泌体相对miR-9-5p表达水平明显高于miR-9-5p对照转染的外泌体（P＜0.05）。转染miR-9-5p抑制剂的MCF-7/TAM细胞外泌体的相对miR-9-5p表达水平低于转染抑制剂空白对照组细胞。将转染后各组外泌体与MCF-7进行共培养后,检测受体细胞MCF-7中miR-9-5p和ADIPOQ表达水平,结果表明,MCF-7细胞株与转染miR-9-5p模拟物的MCF-7来源外泌体共培养后,与模拟物控制组比,miR-9-5p的表达量显著升高（P＜0.05）;ADIPOQ mRNA和蛋白表达量明显降低（P＜0.05）。MCF-7细胞株与转染miR-9-5抑制剂的MCF-7/TAM来源外泌体共培养后,与以自己空白对照组比,miR-9-5p的表达量降低了约70%（P＜0.05）;ADIPOQ mRNA和蛋白表达量明显升高（P＜0.05）。对不同组转染细胞株进行药物敏感性实验,采用CCK-8检测各组细胞活力及计算各组细胞IC50值（μM）,结果提示,MCF-7细胞株与转染miR-9-5p模拟物的MCF-7来源外泌体共培养后,与模拟物空白对照组比,细胞抑制率显著下降（P＜0.05）,IC50增高（P＜0.05）,而且抑制率呈剂量效应关系。用同样的方法检测了miR-9-5p下调对MCF-7的他莫昔芬敏感性影响,结果显示,MCF-7细胞株与转染miR-9-5p抑制剂的MCF-7/TAM来源外泌体共培养后,与抑制剂空白对照组比,细胞抑制率显著上升（P＜0.05）,IC50降低（P＜0.05）,并且抑制率也呈剂量效应关系。采用流式细胞术检测转染细胞的凋亡,结果显示:MCF-7细胞株与转染miR-9-5p模拟物的MCF-7来源外泌体共培养后,与模拟物空白对照组比,细胞的凋亡率显著下降（P＜0.05）。MCF-7细胞株与转染miR-9-5抑制剂的MCF-7/TAM来源外泌体共培养后,与抑制剂空白对照组比,细胞凋亡率显著上升（P＜0.05）。【结论】来源于MCF-7/TAM细胞的外泌体可被敏感细胞MCF-7细胞摄取,并增强敏感细胞MCF-7细胞对TAM的耐药性。miR-9-5p通过负调控ADIPOQ靶基因表达改变了BC细胞对TAM的敏感性。此外,MCF-7/TAM细胞源性miR-9-5p抑制MCF-7细胞凋亡,增强细胞对TAM的抵抗。miR-9-5p通过下调ADIPOQ靶基因的表达增强BC细胞对TAM的耐药性,提示ADIPOQ靶基因可作为BC治疗的候选分子靶点。