研究背景与目的脓毒症是机体对感染产生的全身性炎症反应,最终导致脓毒症休克和多器官功能衰竭。据全美流行病学的调查研究统计,脓毒症患者中有40%～50%合并心肌功能受损,其中出现严重心力衰竭者约占7%。脓毒症心肌病所导致的心肌损伤是重症脓毒症患者死亡的重要原因。有研究发现,脓毒症引起机体的免疫系统的过度应答,尤其是巨噬细胞产生的大量的炎症因子和活性氧簇,对心肌细胞产生不可逆转的损伤。并且有研究指出,心肌细胞的损伤,尤其是心肌收缩功能受限和心肌细胞凋亡,是引起心脏功能不全的重要原因。曲美他嗪(Trimetazidine, TMZ),临床上常用的治疗心绞痛的药物。曲美他嗪通过抑制心肌β氧化途径的关键酶——长链-3-酮酰辅酶A硫解酶,使心肌能量代谢由游离脂肪酸氧化代谢供能为主,转变为由葡萄糖氧化供能为主,是其缓解心绞痛的药理作用机制。正常心肌能量代谢60%-70%来自于脂肪酸β氧化,20%-25%来自葡萄糖的氧化代谢,50%-10%来自糖酵解。而脂肪酸p氧化产生等量的ATP耗氧量要比葡萄糖氧化代谢高。在心肌缺血缺氧时,曲美他嗪能够增加葡萄糖的利用,抑制脂肪酸氧化,进而提高心肌细胞产生能量的效率。近年来,有文献报道,曲美他嗪通过缓解氧化应激,减轻炎症来改善左心室重塑。而在脓毒症心脏病中,曲美他嗪能否发挥作用尚无文献报道。因此在本研究中,我们采用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的脓毒症小鼠模型,探讨曲美他嗪对脓毒症心肌损伤是否有保护作用。并在体外利用巨噬细胞和心肌细胞,研究曲美他嗪对内毒素诱导的巨噬细胞的细胞因子产生及其介导的心肌细胞损伤的作用及可能的分子机制。实验方法和结果1.首先,我们采用C57BL/6小鼠,通过腹腔注射LPS建立脓毒症的动物模型。根据曲美他嗪(TMZ)处理时间的不同,我们分别采用了两种模型,第一种为TMZ预处理模型：即在LPS诱导前三天给予TMZ灌胃处理；第二种为TMZ治疗模型：即在LPS诱导6小时后给予TMZ灌胃处理。通过心脏超声和Millar导管血流动力学检测,评价小鼠的心功能。结果表明,无论是在TMZ预处理模型还是TMZ治疗模型中,TMZ均能显著缓解LPS引起的心脏功能受损,包括提高左心室射血分数和缩短分数,降低左室内径和左室舒张末期压,增加左心室压力上升速率。同时,我们发现TMZ治疗模型中,TMZ明显缓解LPS引起的低血压,增加LPS所诱导的脓毒症心肌病小鼠的存活率。2.对于TMZ预处理模型,LPS注射6小时后,留取心肌组织和血浆。采用心肌TUNEL染色和F4/80免疫组织化学染色检测心肌细胞的凋亡和心脏巨噬细胞的浸润。应用real-time RT-PCR和ELISA检测心肌组织和血浆中的促炎细胞因子的表达。结果表明,在脓毒症小鼠心脏中,心肌细胞凋亡增加,血浆和心脏中的炎症因子(TNFa,MCP-1, IL-1β, IL-6)显著增加,同时伴随着巨噬细胞在心脏中的聚集增多。而TMZ明显缓解了心肌细胞的凋亡,降低血浆和心脏组织中炎症因子的产生,减少巨噬细胞的聚集。3.为了明确TMZ影响巨噬细胞的募集是作用在心脏,还是骨髓,我们进行了骨髓移植实验。将未处理(WT)或者TMZ预先灌胃的小鼠的骨髓移植到经亚致死量放射线照射后的WT或者TMZ组老鼠中,构建了四种骨髓移植嵌合体模型。即(1)将供体小鼠(对照组,WT)的骨髓提取出来,经尾静脉注射入经亚致死剂量放射线照射受体小鼠(对照组,WT)体内(WT>WT组)；(2)将供体小鼠(对照组,WT)的骨髓提取出来,经尾静脉注射入经亚致死剂量放射线照射受体小鼠(在骨髓移植前三天,进行TMZ灌胃组)体内(WT>TMZ组);(3)将供体小鼠(在骨髓移植前三天,进行TMZ灌胃组)的骨髓提取出来,经尾静脉注射入经亚致死剂量放射线照射受体小鼠(对照组,WT)体内(TMZ>WT组)：(4)将供体小鼠(在骨髓移植前三天,进行TMZ灌胃组)的骨髓提取出来,经尾静脉注射入经亚致死剂量放射线照射受体小鼠(在骨髓移植前三天,进行TMZ灌胃组)体内(TMZ>TMZ组)。再用LPS诱导脓毒症模型。LPS注射6小时后,通过心脏超声和Millar导管血流动力学检测,评价小鼠的心功能。随后留取心肌组织,采用苏木素-伊红观察心肌结构,同时应用F4/80染色观察心脏巨噬细胞浸润,以及流式细胞术观察心脏中单核细胞核巨噬细胞的聚集情况。结果显示,接受TMZ预先处理的骨髓移植的小鼠(即TMZ>WT和TMZ>TMZ组)表现出较好的心功能,包括降低的左室的内径和左室舒张末期压,增加的左心室压力上升速率和左心室收缩末期压以及较高的左心室射血分数和缩短分数值。并目.TMZ>WT和TMZ>TMZ组心肌细胞排列整齐,心脏中巨噬细胞聚集显著缓解,且巨噬细胞的降低程度跟其前体单核细胞降低的程度类似。上述结果提示提示TMZ主要通过作用于骨髓源性细胞,而非心肌细胞和其他实质性脏器细胞,减少了脓毒症小鼠心肌组织中的巨噬细胞,及其前体单核细胞的浸润,进而改善了脓毒症心功能损伤。此外,我们还将F4/80染色的巨噬细胞数目和心功能指标进行相关性分析。分析结果表明,心功能的改善和心脏中巨噬细胞的数目呈负相关。即心脏中巨噬细胞数目越多,心功能越差。4.接下来的研究中我们通过流式分选分别获得了有TMZ预处理和无TMZ预处理条件下,LPS诱导的小鼠心脏中的巨噬细胞。同时提取了原代腹腔巨噬细胞,采用TMZ、LPS干预。应用real-time RT-PCR检测了分选的心脏巨噬细胞和干预的原代腹腔巨噬细胞中炎症因子的表达。结果显示TMZ能够明显的减少脓毒症小鼠心脏巨噬细胞以及LPS干预的原代腹腔巨噬细胞炎症因子的表达,表明TMZ在抑制心脏巨噬细胞和腹腔原代巨噬细胞的炎症因子的产生的效应是一致的。鉴于分选的心脏巨噬细胞数量极低,因此在接下来的研究中,我们采用了腹腔原代巨噬细胞作为研究对象。5.为了进一步研究巨噬细胞是否跟心肌细胞之间存在交互作用(相互影响),我们将巨噬细胞跟原代心肌细胞利用Transwell小室进行共同培养。Transwell、室上层的巨噬细胞经过预先加药处理(LPS, TMZ, LPS+TMZ和LPS+促炎细胞因子中和抗体)后,再跟下层的心肌细胞培养,然后用流式细胞术检测心肌细胞的凋亡情况。研究结果表明,LPS处理的巨噬细胞能明显增加心肌细胞凋亡,TMZ预处理的巨噬细胞则能显著降低LPS诱导的心肌细胞凋亡。而LPS+促炎细胞因子中和抗体组的巨噬细胞诱导心肌细胞凋亡的能力也下降,这一效应与TMZ类似,说明TMZ可能通过降低巨噬细胞中炎症因子的表达,从而缓解巨噬细胞所介导的心肌细胞凋亡。6.在体外培养的原代腹腔巨噬细胞中,我们采用TMZ、LPS干预,同时加入ROS的清除剂NAC,采用荧光探针DHE检测巨噬细胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平,同时应用real-time RT-PCR检测巨噬细胞的炎症因子表达。结果提示TMZ降低LPS诱导的ROS的生成和促炎细胞因子表达,这一效应与加入了ROS的清除剂NAC类似。7.在分子机制方面,首先在TMZ预处理模型留取的心肌组织中,提取蛋白,采用Western blotting检测细胞核和细胞浆内的Sirt1蛋白表达水平。结果提示,LPS明显抑制Sirt1由胞浆进入胞核,TMZ显著增加Sirt1从胞浆进入胞核。在体外,以原代腹腔巨噬细胞作为研究对象,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制剂NAM或转染Sirt1的si-RNA干预后,通过Western blotting检测细胞核和细胞浆内的Sirt1以及NADPH亚基gp91phox和p47phox的蛋白表达水平,荧光探针DHE检测巨噬细胞内ROS的水平,以及real-time RT-PCR检测巨噬细胞的炎症因子表达水平。结果表明,LPS明显增加巨噬细胞ROS的生成和促炎细胞因子的表达以及gp91phox和p47phox的蛋白表达,抑制Sirt1由胞浆进入胞核。而TMZ显著的抑制LPS诱导的ROS的生成和促炎细胞因子的表达以及gp91phox和p47phox的蛋白表达,并且增加Sirt1从胞浆进入胞核。然而TMZ的抑制LPS诱导巨噬细胞ROS介导的炎症应答的这一效应,能被Sirt1抑制剂NAM阻断,说明TMZ通过Sirt1在巨噬细胞中发挥抗氧化应激作用,并降低炎症因子的释放。8.进一步,在体外培养的原代腹腔巨噬细胞中,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制剂NAM干预后,收集蛋白,通过Western blotting检测p-AMPK和AMPK的蛋白表达水平。结果表明LPS显著抑制AMPK的磷酸化水平,TMZ显著增加LPS抑制的AMPK的磷酸化水平。而加入Sirt1的抑制剂NAM或者转染Sirt1的si-RNA后,TMZ增加AMPK的磷酸化水平被抑制。说明TMZ能够通过Sirt1影响AMPK的磷酸化水平。同时,我们还采用了AMPK抑制剂Compound C干预。干预后收集蛋白,通过Western blotting检测Nrf2和HO-1的蛋白表达水平。并采用荧光探针DHE检测ROS的水平,以及real-time RT-PCR检测炎症因子的表达。结果提示TMZ显著增加LPS抑制的Nrf2和HO-1的表达水平,降低LPS诱导的ROS的生成和促炎细胞因子的表达。而AMPK的抑制剂Compound C逆转了TMZ增加Nrf2和HO-1的表达的作用,抑制了TMZ的抗氧化应激和缓解炎症因子释放的作用。以上结果提示,TMZ通过Sirt1/AMPK,增加Nrf2和HO-1的表达水平,减少ROS的生成,最终缓解巨噬细胞的促炎应答。9.另一方面,在体外培养的原代腹腔巨噬细胞中,采用TMZ、LPS和Sirt1抑制剂NAM干预后,收集蛋白,用Western blotting检测核PPARa的表达。结果表明LPS显著降低核PPARa的表达水平。与LPS组相比,TMZ显著增加巨噬细胞的核PPARa的表达。而Sirtl抑制剂NAM部分阻断了TMZ增加LPS诱导的巨噬细胞的核PPARa的表达的作用,提示TMZ能够通过Sirtl影响核PPARa的表达。进一步,采用TMZ、 LPS和PPARa拮抗剂GW6471干预原代腹腔巨噬细胞后,收集蛋白,用Western blotting检测IκBa磷酸化和核p65的表达水平,同时,采用荧光探针DHE检测ROS的水平,以及real-time RT-PCR检测炎症因子的表达。结果提示TMZ能显著降低LPS导致的p-lκBa/IκBα和NF-κBp65的表达增加,降低LPS诱导的ROS的生成和促炎细胞因子的表达。PPARa拮抗剂GW6471部分阻断了TMZ降低p-IκBα/IκBa和NF-κB p65表达的作用,抑制了TMZ的抗氧化应激和缓解炎症因子释放的作用。以上结果提示TMZ通过Sirt1/PPARa,减弱p-IκBα和核p65的表达,减少ROS的生成,最终缓解巨噬细胞的促炎应答。10.最后,我们收集了经LPS,LPS+TMZ, LPS+TMZ+抑制剂(Sirtl抑制剂NAM,AMPK抑制剂Compound C和PPARa拮抗剂GW6471)处理过的巨噬细胞条件培养基,干预心肌细胞,并用ELISA对巨噬细胞条件培养基中的炎症因子的检测。同时用流式细胞术,检测条件培养基处理的心肌细胞的凋亡水平。ELISA结果提示TMZ降低LPS导致的促炎细胞因子的释放,而Sirtl, AMPK和PPARa的抑制剂逆转了TMZ降低促炎细胞因子释放的作用。流式细胞术结果显示LPS处理的条件培养基可以显著增加心肌细胞的凋亡,LPS+TMZ处理的条件培养基则细胞凋亡明显降低,而TMZ的效应可以被Sirtl抑制剂NAM,AMPK抑制剂Compound C和PPARa拮抗剂GW6471所阻断。以上结果表明,TMZ通过影响Sirt1/AMPK和Sirt1/PPARa这些分子进而影响炎症因子的表达,最终缓解巨噬细胞所介导的心肌细胞凋亡作用。结论曲美他嗪能够改善内毒素诱导的脓毒症心肌损伤。缓解脓毒症心肌损伤的机制主要是通过减轻心脏中巨噬细胞的浸润和巨噬细胞炎症应答所介导的心肌细胞凋亡,这为脓毒症心肌功能障碍提供一个新的预防和治疗策略。