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高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box-1 protein,HMGB1)是一种非组蛋白核蛋白,广泛存在于真核生物细胞中,在许多生命活动中发挥重要作用。HMGB1的分布广泛且分布决定功能。当机体处于稳态时,HMGB1主要位于细胞核内,能与DNA上的小沟发生非特异性结合,改变空间构象,调节染色质细胞结构,在DNA重组、复制、转录调节和损伤修复中发挥功能,维持染色质稳定。在机体受到刺激后,HMGB1的空间位置发生改变,由坏死细胞或活化的免疫细胞释放到细胞外,成为趋化因子或促炎细胞因子,与相应受体结合促进炎症反应,进而引发一系列的生物学效应。B淋巴细胞在骨髓中发育成熟后经血液迁移至外周免疫器官,产生抗体消灭病原体,参与免疫调节,介导体液免疫应答。B细胞通过B细胞受体(B cell receptor,BCR)结合抗原,Igα和Igβ将识别抗原的第一信号传递,启动下游级联信号分子的激活,导致B细胞的增殖和分化。BCR介导的信号转导对于B细胞发育和适应性免疫至关重要。研究背景:HMGB1在中性粒细胞、树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞等多种免疫细胞中均能起到重要的调控作用,参与自身免疫性疾病的发生发展。目前HMGB1在淋巴细胞中的作用已有不少研究进展,但关于HMGB1在B细胞中的相关研究较少,特别是对于BCR信号的调节及其机制仍未见详细报道。目的:本课题围绕小鼠B淋巴细胞中Hmgb1基因缺失展开,旨在研究B细胞中Hmgb1缺失后对B细胞发育、分化的影响以及HMGB1对BCR信号调节的机制研究。通过建立小鼠T细胞依赖的免疫应答模型探究HMGB1在体液免疫应答中所发挥的功能性作用。方法:构建Hmgb1基因在B细胞中条件性敲除的小鼠模型,所有小鼠均经基因鉴定确认其基因型。选择年龄在6-8w的小鼠,根据基因型结果将小鼠分为敲除组KO(knockout)和对照组WT(wildtype)进行下续实验研究。通过流式细胞术检测Hmgb1缺失对于骨髓、外周B细胞关键亚群以及固有免疫B1细胞的影响,统计分析各亚群百分比及相应的细胞总数。明确HMGB1是否参与BCR激活,通过激光共聚焦和免疫印迹法探究Hmgb1缺失后对BCR近端信号分子激活的影响,检测其与BCR之间的时空关系和在B细胞中的表达水平,以及检测Hmgb1缺失对BCR代谢相关信号分子的影响。接下来,研究Hmgb1缺失后对于肌动蛋白细胞骨架的影响和对B细胞的扩张情况和BCR簇的影响。检测Hmgb1缺失后对部分核转录因子NK-κB等激活后的改变。最后,探究究Hmgb1缺失对体液免疫应答的影响。结果:(1)HMGB1对骨髓B细胞的发育是非必需的,但对外周B细胞的分化和固有免疫至关重要,并对维持免疫耐受起到重要作用。与WT小鼠相比,Hmgb1 KO小鼠骨髓B细胞六大亚群的百分比、细胞数以及CD127、CD22的表达均无显著差异。与WT小鼠相比,KO小鼠脾脏B细胞中FO、T1、GCB细胞亚群的比例和数目无显著差异。但KO小鼠T2 B细胞的比例明显高于WT小鼠,且MZB细胞的比例和细胞数均显著高于WT小鼠。此外,KO小鼠B1a细胞的百分比和细胞数目均明显高于WT小鼠。KO小鼠肾脏肾小球中IgG沉积明显高于WT小鼠。(2)HMGB1参与BCR激活并下调BCR信号,负向调控BCR代谢信号相关分子。共聚焦显微镜下观察到,HMGB1随着BCR的激活在质膜上重新分布并和BCR簇发生高度共定位。可溶性抗原刺激后,Hmgb1 KO小鼠脾脏B细胞中pCD19、pY、pBTK、pSHIP分别与BCR之间的共定位高于WT小鼠脾脏B 细胞,KOB 细胞中 pCD19/CD19、pY/actin、pBTK/BTK、pSHIP/SHIP 的表达高于 WT B 细胞。抗原刺激后,pPI3K/PI3K、pAKT/AKT、pFOXO1/FOXO1、pS6/S6、pmTOR/mTOR的表达在KO B细胞中也明显高于WTB细胞。(3)Hmgb1缺失导致B细胞激活过程中肌动蛋白聚合增加,增强了 B细胞的扩增和BCR的聚集,加强了 BCR信号转导。Hmgb1 KO小鼠脾脏B细胞中F-actin在抗原刺激后聚合增加,pWASP与BCR之间的共定位也明显高于WT小鼠脾脏B细胞。磷酸化流式检测F-actin和pWASP经抗原刺激后在KO B细胞中的表达均高于WT B细胞。WB检测pWASP/WASP、pEZRIN、WIP以及DOCK8经抗原刺激后在KO B细胞中蛋白表达水平均高于WT B细胞。全反射荧光显微镜下检测观察到,经膜抗原刺激后,KOB细胞的扩展程度和BCR聚集均显著高于WTB细胞,F-actin、pWASP、pBTK、pY、pSHIP的信号增高。(4)Hmgb1缺失影响了转录因子NF-κB、STAT1及STAT5的激活。共聚焦显微镜检测发现,Hmgb1 KO小鼠脾脏B细胞经抗原刺激后,pSTAT1与BCR之间的共定位在5min时显著降低,pSTAT5与BCR在激活后则一直保持高度的共定位关系,pSTAT1、pSTAT5分别与HMGB1之间的共定位也在5min时明显升高直至30min时回降。WB检测pSTAT1/STAT1表达降低,pSTAT5/STAT5表达增高。(5)Hmgb1 KO小鼠体液免疫应答降低。TD抗原免疫后,Hmgb1 KO小鼠脾脏B细胞中FO的比例和数目均明显低于WT,T1B的百分比降低的,FO、T1、T2、MZ的细胞数目均显著增高。免疫后KO小鼠GCB细胞的百分比和数目均明显降低,MBC的比例和Switched的细胞数在免疫后也显著降低。结论:HMGB1参与BCR激活,影响体液免疫应答。HMGB1通过影响B细胞激活过程中肌动蛋白的重组,进而影响B细胞的扩增和BCR的聚集,调控BCR的信号传递,负向调控BCR信号分子,最终影响外周B细胞的分化。