论文部分内容阅读
锌指蛋白403（zinc finger protein403,ZNF403）,又称GGNBP2（gametogenetin binding protein2）,定位于人染色体17q12-17q21.1,该区位于乳腺癌,前列腺癌和喉癌等肿瘤的遗传易感区域内,其GenBank序列号为NM024835.3。ZNF403基因在生物物种进化中高度保守。目前已知人类ZNF403基因含有两种不同的RNA转录剪切本。其中一个截短型剪切本为本室李友军等采用RNA差异显示法从喉癌组织中所鉴定获得,称喉癌相关基因1（Laryngeal Carcinoma related gene1, LCRG1）,仅含有7个外显子,编码一个含288个氨基酸的蛋白。以往研究显示LCRG1在喉癌的发生、发展中发挥重要的抑瘤作用。另一个全长转录本,含有14个外显子,编码一个含696个氨基酸的蛋白质,其编码的蛋白目前功能尚不明确。因此本研究将以探讨ZNF403全长转录本在肿瘤细胞中的生物功能为目的,以期更全面的揭示该基因在肿瘤发生发展中的作用。本研究采用辅助依赖型腺病毒载体介导的RNA干扰技术对ZNF403进行全面的功能缺失型研究。首先采用Cre-loxp生产系统,成功构建生产了高纯度高效率的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒干扰表达系统,在获得特异高效的内源性表达沉默效果后,进一步对ZNF403表达缺失的肿瘤细胞进行生物学特性分析,在体内对细胞增殖,非停泊依赖性生长和细胞迁移活性进行探讨,并在体外对其细胞增殖影响进行了验证。为了揭示ZNF403影响细胞增殖生长的分子机制,同时采用碘化丙碇和BrdU标记的流式细胞分析术对ZNF403缺失在细胞周期中的影响进行分析,并采用高通量精确的人类细胞周期Realtime PCR array,全面比较ZNF403缺失后84个关键细胞周期相关调控基因的表达水平变化,并采用Western blot对部分重要基因的蛋白水平变化进行验证,以期明确ZNF403在细胞周期调控网络中的角色和位置。此外,本研究还对候选ZNF403基因的上游转录调控区进行了初步研究分析,成功克隆其5’-端启动子区域,并利用缺失突变、报告基因、转染技术对该基因启动子区域进行初步鉴定,同时采用TCDD药物处理分析特殊转录因子AHR结合位点的调控影响。本研究首次发现ZNF403基因为一个新的细胞周期调控蛋白,抑制ZNF403的表达能通过阻滞细胞周期的S期和G2/M检测点,显著抑制肿瘤的增殖,为肿瘤发生发展的分子机制提供了有价值的线索。[ZNF403基因结构,同源性分析及在肿瘤细胞系中的表达检测]ZNF403基因定位于肿瘤相关的遗传易感区17q12-17q21.1.区域内,该基因的全长转录本为2869bp,含有14个外显子,编码序列（CDS）位置为317-2410,编码一个包含696个氨基酸的蛋白质（蛋白序列登录号：Q9H3C7.1）。由于剪接方式不同目前已知形成至少2种mRNA剪接变异体,编码至少2种不同的蛋白质。除全长转录本ZNF403外,其剪切异构转录本LCRG1的全长为3448bp,包括7个外显子,编码一个由288个氨基酸组成的蛋白。利用比较基因组学分析发现人ZNF403基因在黑猩猩、猕猴、狗、牛及小鼠等多种动物中高度同源,提示该基因在进化中的的高度保守性。本研究采用特异性引物在不同细胞株中分别对ZNF403和LCRG1的表达进行Real time PCR检测,结果显示ZNF403的表达水平比LCRG1高大约10倍,而Western Blot方法仅能检测到ZNF403蛋白的表达,以上结果说明ZNF403为该基因的主要转录表达产物。[辅助依赖型腺病毒介导的人类ZNF403基因RNA干扰系统的设计,构建和鉴定]采用基于RNA聚合酶Ⅲ,鼠源性U6启动子的DNA载体构建表达shRNA。特异性针对ZNF403的目标序列如下：5’-GGGCAAATTCTGAAGAGAACGACA-3’。采用两对互补的DNA oligos构建一个含有U6promoter和ZNF403shRNA的辅助依赖型腺病毒（HD-Ad vector）质粒形式载体HD-Ad-ZNF403-shRNA。然后经PmeI酶切该质粒载体,暴露病毒末端倒置重复序列,再与辅助性病毒的共同感染116细胞,采用Cre/loxP系统进行辅助依赖型腺病毒的生产。经过拯救,扩增和大量扩增三大步骤后收集细胞,采用氯化铯不连续密度梯度离心及透析纯化病毒,经浓度和纯度检测得到了高浓度高纯度的HD-Ad-ZNF403-shRNA病毒载体。为检测该载体的RNA干扰效率,采用不同浓度的HD-Ad-ZNF403-shRNA和无效应HD-Ad-shRNA-control对ZNF403表达水平高的Hep-2和HEK293细胞进行感染,Realtime PCR检测结果显示HDAd-ZNF403-shRNA对ZNF403内源性mRNA表达水平有显著高效的干扰抑制效应。50MOI为用量最小且干扰效果最明显的载体浓度。Western blot检测说明在50MOI时,内源性ZNF403蛋白表达完全缺如,干扰效果好。同时结果显示,HDAd-ZNF403-shRNA不影响LCRG1的表达,证实了其RNA干扰的特异性。[ZNF403表达抑制后的肿瘤生物学特性研究]采用HD-Ad-ZNF403-shRNA和无效应HD-Ad-shRNA-control对Hep-2和HEK293细胞分别进行感染（50MOI）,24小时后,经过Realtime PCR验证其内源性ZNF403表达抑制效果后,进行后续肿瘤生物学功能研究实验。采用BrdU标记细胞增殖Elisa方法,结果显示ZNF403缺失在体内显著抑制细胞增殖活动,该结果得到了体外裸鼠成瘤实验的证实。此外,软琼脂集落形成实验提示ZNF403缺失对肿瘤细胞非停泊依赖性生长有明显损伤抑制效应；同时,细胞划痕试验显示ZNF403缺失亦对肿瘤细胞的迁移活动具有抑制效应。综合以上研究结果,初步揭示ZNF403缺失能在体内体外均具有抑制细胞增殖的效应,并能显著降低喉癌细胞的恶性表型。[7NF403在细胞周期中的作用机制研究]首先采用生物信息学软件ELM对ZNF403蛋白的功能结构域进行分析预测,发现存在多个与细胞周期相关的结构域,如RBLXCXE motif, Cyclins结合位点,PCNA结合位点等,提示ZNF403可能通过调节细胞周期对细胞增殖产生影响。继而采用碘化丙碇（PI）标记的流式细胞术检测ZNF403基因表达抑制后对细胞各周期的影响。结果表明,ZNF403基因表达抑制能导致G2/M阻滞,并轻度影响S期的进程。当采用不同剂量的HD-Ad-ZNF403-shRNA的感染细胞时,ZNF403的缺失导致的细胞周期G2/M期阻滞呈剂量相关效应。同时不同时间点的分析发现ZNF403的缺失对细胞周期的影响为非一过性的短期细胞反应,而是稳定的G2/M阻滞作用。此外,BrdU标记的动态细胞周期进程分析进一步验证了ZNF403的缺失导致的G2/M期阻滞。为了揭示ZNF403在细胞周期调控中的分子机制,采用高通量精确的人类细胞周期Realtime PCR array,全面比较ZNF403缺失后84个关键细胞周期相关调控基因的表达水平变化,提示以P21,MCM2,ATM, MRE11A为代表的多个细胞周期基因RNA水平发生显著改变。同时上述4个基因的表达变化在蛋白水平亦得到证实。该研究结果合理解释了ZNF403表达抑制对细胞增殖的抑制效应,首次报道了ZNF403在细胞周期中的重要功能,并初步对其在细胞周期中的调控分子机制进行了探讨。[ZNF403基因启动子区的预测,克隆,分离鉴定及其调控元件的初步分析]首先利用多个生物信息学软件预测ZNF403基因CpG岛及其启动子区域。经在线程序CpGplot, Methprimer, FirstEF, Gene2promoter和NNPP的启动子预测分析,并结合TSSs预测、CpG岛预测结果,初步认为ZNF403基因启动子位于（-1465,+199）较长区间内,并选取该1646bp片段构建一系列5’-或3’-端缺失的启动子片段荧光素酶报告基因载体,经瞬时转染细胞,双荧光素酶活性检测,结果表明ZNF403基因核心启动子定位于（-926～-682）区间。采用MatlnspectorV2.2和TESS软件搜索转录因子结合位点,显示核心启动子区存在AHR,E2F1等重要调控元件,同时保守进化足迹软件ECR发现AHR转录因子结合位点高度保守地同时存在于小鼠的5’端调控区和人ZNF403基因启动子区。采用AHR刺激物TCDD处理细胞,并检测启动子活性变化,结果显示TCDD处理的细胞启动子活性上升,这表明TCDD对ZNF403的表达调控可能是通过其启动子区域的AHR结合位点实现的,提示ZNF403可能为AHR致癌机制中一个重要的下游基因。