一、研究背景肝纤维化是全球发病率较高的疾病,它不是一个独立的疾病,许多慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化,包括慢性病毒性肝炎,酒精性肝炎和非酒精性脂肪肝炎等。肝纤维化是指由各种致病因子所致肝损伤修复的过程伴随结缔组织异常增生,以肝内弥漫性细胞外基质(ECM)过度沉积为特点的病理过程。越来越多的研究着眼于肝纤维化的病理机制,肌成纤维细胞(MF)以其合成并分泌胶原促进肝脏ECM的累积和收缩能力成为研究的热点。MF虽来源广泛,肝星状细胞(HSCs)依然是CC14所致的小鼠肝纤维化模型中肌成纤维细胞的主要来源。肝损伤时HSCs由静止的富含维生素的星状细胞活化为具有增殖、收缩和促纤维化能力的肌成纤维细胞,这样的细胞转变在理解肝纤维化发病机制的道路上具有划时代意义。HSCs不仅在肝损伤具有重要的功能,在肝发育、再生、异型生物质反应、代谢、免疫调节方面都发挥着重要的作用。与此同时,无数的研究利用组织免疫组织化学鉴定肝星状细胞,但迄今为止最具代表性的蛋白质包括平滑肌肌动蛋白(α -SMA)、结蛋白(desmin)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其在体内由两种不同的复合物组成,分别是mTORC1 (mTOR complex 1)和mTORC2 (mTOR complex 2)。mTORC1包括mTOR、Raptor、mLST8、PRAS40和Deptor; mTORC2包括mTOR、Rictor、 mSIN1、Protor-1、LST8和Deptor。结节性硬化复合物(TSC1/2)由TSC1和TSC2组成,对mTOR功能起负性调控作用,TSC1的缺失会导致组织细胞中mTOC1活性的持续激活。mTOC1可对细胞内外多种刺激产生应答反应,通过磷酸化其下游蛋白4EBP1和P70S6K,进而增加mRNA翻译效率,增加蛋白质合成,调控细胞生长和增殖。在一定条件下,通过雷帕霉素抑制mTORC1活性可以促进凋亡。mTOR的突变激活会引起凋亡抵抗,可能导致细胞转化。据报道,mTOR信号通路活化与多种纤维化疾病有关。mTOR信号通路在心肌纤维化中起重要作用,雷帕霉素作为mTOR信号通路抑制剂可以缓解心脏纤维化。雷帕霉素类似物SDZ和RAD对博莱霉素致小鼠肺纤维化模型中胶原积累有明显的抑制作用,抑制mTOR对肺纤维化有潜在的治疗作用。mTORC1信号信号通路可以促进肾成纤维细胞的活化,并有助于肾间质纤维化的发展。越来越多的证据支持mTOR信号通路在肝纤维化起重要作用。肝星状细胞激活是肝纤维化的发病机制中的关键步骤。肝星状细胞是位于Disse间隙内,紧贴着肝窦内皮细胞和肝细胞的间质细胞。我们推测的mTOR信号通路在间充质细胞激活对肝纤维化有重要作用。二、研究方法1、基于Cre-loxp系统,我们成功构建了间质细胞特异性TSC1敲除小鼠。应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行小鼠基因型的鉴定。2、他莫昔芬诱导间质细胞特异性TSC1敲除小鼠,用western blot和免疫荧光确定TSC1敲除效果。3、采用四氯化碳(CC14)小鼠腹腔注射给药,模拟肝纤维化模型,对照组给予同等剂量甘油。检测小鼠血清的ALT,肝组织检测匀浆羟脯氨酸(HYP)。取肝组织进行HE和天狼星红染色,观察小鼠肝组织的损伤程度和胶原增生的情况。4、在小鼠动物模型,通过免疫组化及western blot方法,评估在间质细胞内mTOR过度活化情况下对肝纤维化形成的影响。5、通过对间质细胞特异性敲除TSC1mRNA分析,初步探讨mTORC1信号通路对促纤维化发生发展的基因的影响6、在小鼠动物模型,使用western blot检测及免疫荧光来评估小鼠肝组织内的增殖及凋亡水平变化情况。三、统计学处理所有数据均代表3次或以上重复实验的结果,以均数±标准误表示,每组数据使用t检验进行分析。检验水准：P<0.05有统计学意义。四、研究结果1、构建间质细胞特异性TSC1敲除小鼠,并对2月龄小鼠进行他莫昔芬诱导,使其产生敲除效果。纯合子TSC1小鼠(Tsc1fl/fl)与含有Cre-ER (T)重组酶基因的小鼠杂交繁殖出Cre/TSC1杂合的老鼠。经过第二代杂交繁殖出Cre酶阳性纯合子[TSC1fl/fl, ColⅠα2-CreER(T)+/0]和Cre酶阴性纯合子[TSC1fl/fl, ColIa2-CreER(T)0/0]小鼠。我们裂解鼠尾组织样本提取DNA,应用PCR和琼脂糖凝胶电泳进行基因型鉴定。接着对2月龄的小鼠分别持续给予他莫昔芬8天,产生间质细胞特异敲除TSC1小鼠(TSC1 CKO)及对照野生型小鼠(WT)。给药1个月后取肝组织,通过western blot和免疫荧光验证敲除效果。肝组织匀浆裂解,通过western blot检测肝组织蛋白mTORC 1下游靶蛋白S6的磷酸化水平。我们发现间质细胞TSC1特异性敲除小鼠p-S6 (5235/S236)的水平显著升高。肝组织固定包埋,免疫荧光发现p-S6(5235/S236)表达阳性的细胞显著增多。2、间质细胞敲除TSC1加重CC14致小鼠肝纤维化。评估间质细胞敲除TSC1对CC14致小鼠肝纤维化的影响,取TSC1 CKO和WT老鼠肝组织固定包埋,进行HE染色和天狼星红染色染色观察肝损伤程度及胶原形成情况。与WT老鼠相比,TSC1 CKO的老鼠表现出明显的肝小叶结构破坏和桥接坏死。TSC1 CKO小鼠呈现出胶原沉积增加,天狼星红染色阳性面积增多,肝羟脯氨酸作为肝内胶原降解产物在敲除鼠内也明显升高。同样的,TSC1 CKO小鼠血清ALT也明显升高相对于WT老鼠。总的来说,这些结果表明,在间质细胞敲除TSC1加重CC14所致的小鼠肝纤维化。3、间质细胞TSC1缺失增加a-SMA表达。鉴于我们上面的分析已确定间质细胞TSC1缺失导致四氯化碳诱导的肝纤维化加重。与上面形态学结果一致,在CC1 4诱导模型中TSC1 CKO小鼠肝组织a-SMA蛋白表达增加。免疫组化分析证实在TSC1 CKO小鼠中a-SMA蛋白表达阳性的细胞显著增多。橄榄油处理后,WT和TSC1 CKO小鼠肝组织a-SMA的表达没有明显的差异。这些结果表明,从间质细胞TSC1缺失促进肝纤维化的发展。4、TSC1 CKO小鼠肝纤维化标志物的表达增加。RT-PCR以定量纤维化标记物的表达。四氯化碳诱的纤维化模型中,TSC1 CKO小鼠a-SMA,Ⅰ型胶原,TGF-β和TIMP2明显增加相对于WT小鼠而言。这些标记物在橄榄油诱导小鼠中没有明显差异。这一结果更进一步说明了TSC1 CKO小鼠对四氯化碳诱导肝纤维化明显的易感性。5、肝纤维化模型中TSC1 CKO小鼠肌成纤维细胞(myofibroblasts， MF)增多。为了进一步明确mTOR活性对MF增加的原因,通过蛋白质检测和免疫荧光分析。正如所料,四氯化碳处理的小鼠,S6磷酸化水平上调,但在TSC1 CKO升高的更明显。我们进一步发现凋亡蛋白的蛋白水平,PARP和活化的caspas3在CCl 4处理的小鼠肝组织表达降低,但在TSC1 CKO降低的更加明显。通过免疫荧光分析用α-SMA抗体测定肌成纤维细胞的形成。与western blot的结果一致,在CC14处理的小鼠肝组织,TSC1 CKO小鼠S6磷酸化水平增加对肌成纤维细胞形成有一定的促进作用。Ki67和α-SMA双阳性细胞被认为是增殖的肌成纤维细胞,CCl 4处理的小鼠肝组织中显著增多,但TSC1 CKO小鼠增加更为显著。活化的caspas3和α-SMA的双阳性细胞,在TSC1 CKO肝纤维化模型鼠肝脏组织中明显降低,这是公认的凋亡肌成纤维细胞。有趣的是,在橄榄油处理过的小鼠肝脏中α-SMA,Ki67和活化的caspas3表达不会有明显改变。这表明在型胶原TSC1的静态条件失去我表达细胞并没有伴随着肌纤维母细胞在肝脏的外观增加。因此,在间质细胞特异性敲除TSC1导致间质细胞内rnTOR信号通路过度活化,mTOR活化能促进肌成纤维细胞的产生从而加重四氯化碳所致小鼠肝纤维化。五、结论1、肝纤维化发病程中伴随着mTOR信号通路的活化。2、间质细胞内敲除TSC1,mTOR信号通路活化促进肝纤维化发病。3、间质细胞内mTOR信号通路活化促进肌成纤维细胞增殖加重肝纤维化。4、间质细胞内mTOR信号通路活化通过减少肌成纤维细胞凋亡加重肝纤维化。