随着现代工业的不断发展,能源、资源和环境问题日益突出,迫切需要对传统制造工业进行创新。绿色生物制造是利用微生物细胞或酶蛋白催化低廉、可再生的原料进行高效和大规模物质加工与物质转化,生产高附加值产品的新行业,在生物燃料、医药中间体、化工产品生产方面具有良好的应用前景和极佳的社会经济效益。异丁醇是新一代生物燃料,性能优于乙醇。高产、稳定并抗逆的细胞工厂是实现异丁醇绿色生物制造的关键,其构建依赖于合成生物学技术。CRISPR/Cas9是一种新型、高效的基因编辑技术,已在多个物种中成功应用,可以用于高产异丁醇的大肠杆菌的构建。本文构建了大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统,在国际上首次对超过50kb的大片段实现了依赖同源重组的删除及替换,并建立了成熟的方法体系。本文通过构建靶向目的基因的sg RNA质粒、含修复模板的供体(Donor)片段(含有紫色蛋白筛选基因),使过表达的Cas9蛋白在大肠杆菌中对基因组进行定向切割从而敲除目的片段,并利用大肠杆菌同源重组修复系统将紫色蛋白基因替换到基因组相应位置。本文中,菌落颜色(紫色)可以作为快速挑选阳性克隆的依据。按照本论文建立的体系,本实验室在大肠杆菌基因组中分别删除了28个超过50kb的大片段区域,获得了一系列的突变菌株。本文进而将上述这些突变菌株在高温、Na Cl、Na AC、糠醛、异丁醇等各种天然胁迫条件下进行培养,观察各突变菌在胁迫及非胁迫条件下的生长情况,从而确定微生物抗逆机制中的有益和有害基因,并最终筛选出多个可以有效抵御特定逆境条件的突变菌株。进一步分析其基因型,抗胁迫靶点,为明确具体基因功能和菌株改造提供依据。本文还以酸胁迫和营养匮乏这两种逆境条件为例,优化了异丁醇生产菌株的基因表达、培养条件和过程控制,从而提高了异丁醇的发酵水平,可以在摇瓶中达到30 g/L。综上所述,本论文针对宿主细胞在工业发酵过程中所面对的逆境胁迫问题进行研究,通过CRISPR/Cas9技术对大肠杆菌逆境胁迫的相关基因进行了高通量的筛选,并以酸性等条件下异丁醇的生产为例研究了如何维持逆境条件下代谢产物的生产。本文的研究内容将对工业菌株的改造和对发酵过程的优化提供帮助。