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蛋白质乙酰化是真核生物体内普遍存在的可逆蛋白质修饰方式,由组蛋白乙酰转移酶(HATs)和组蛋白去乙酰转移酶(HDACs)共同作用,根据植物的生长发育需要和外界生存环境的改变,动态调节植物体的乙酰化水平,从而调节不同基因的表达来维持植物的生存需要。本研究利用生物信息学的方法,对玉米组蛋白去乙酰化转移酶(HDAC)家族的基因进行分析,获得了与拟南芥AtHDA19同源的玉米ZmHDA101基因,基因代码为GRMZM2G172883;利用Real-time PCR技术,分析了HDAC家族基因在玉米响应水杨酸和茉莉酸激素处理过程中的表达情况;构建了GFP与ZmHDA101融合表达的载体,对ZmHDA1Ol基因进行亚细胞定位分析;通过检测玉米ZmHDA101过表达植株对禾谷镰孢、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌的抗病性,分析ZmHDA101基因在玉米抗病过程中的功能;利用酵母双杂交技术,对ZmHDA101与TPL/TPRs的互作关系进行研究,为阐明玉米HDAC家族基因在玉米抵抗牛物、非生物胁迫过程中的功能及机制奠定了基础。主要结果如下:
1.玉米HDAC家族基因的生物信息学分析。对玉米HDAC家族基因的系统发育和结构域进行分析,发现玉米HDAC家族基因可分为5个亚家族(ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、SRT和HD2),其中ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ亚家族均包含上乙酰转移酶特有的结构域HDAC,ZmHDA101属于ClassⅠ亚家族。利用生物信息学方法,对玉米HDAC家族基因的组织特异性、非生物胁迫和生物胁迫下表达分析,发现HDAC家族基因在玉米不同发育时期、不同组织以及响应不同非生物胁迫和生物胁迫过程中的表达水平表现出明显的差别。其中ZmHDA101基因在植株不同部位表达较为平稳,在高温、高盐胁迫下表达明显上调。推洲玉米HDAC家族基因参与玉米生长、发育和响应非生物和生物胁迫过程。
2.玉米HDAC家族基因在玉米响应水杨酸和茉莉酸激素过程中的表达规律分析。利用Real-time PCR技术,检测玉米HDAC家族基因在玉米响应水杨酸和茉莉酸激素过程中的表达情况,结果发现玉米HDAC家族基因在响应水杨酸、茉莉酸处理过程中呈现不同的规律。ZmHDA101基因在茉莉酸激素处理下呈现诱导上调的表达趋势,在水杨酸处理下呈现下调表达趋势,推测其参与茉莉酸和水杨酸的信号转导途径。
3.ZmHDA101的亚细胞定位分析。利用Gateway技术,构建了ZmHDA101与GFP融合表达的载体103-ZmHDA101。利用农杆菌介导的遗传转化方法,将103-ZmHDA101转化至烟草叶片细胞中进行瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察到细胞核和细胞质膜上有GFP的绿色荧光信号,确定了ZmHDA101基因定位于细胞核和细胞质膜中。
4.ZmHDA101在玉米抗病过程中的功能研究。将ZmHDA101过表达植株接种禾谷镰孢、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌,进行抗病性鉴定。结果发现,与玉米自交系B73相比,ZmHDA101过表达植株对试验接种的供试病原菌均表现出明显的抗性,表明ZmHDA101在玉米抗病过程中具有重要作用。利用Real-time PCR技术,检测玉米自交系B73、ZmHDA101过表达植株中PRs基因的表达水平。结果发现,在未接种和接种禾谷镰孢48h的ZmHDA101过表达植株中PRs基因的表达量均明湿低于自交系B73,表明ZmHDA101的过表达影响PRs基因的表达,进一步说明了ZmHDA101在玉米抵抗病菌侵染中发挥重要的作用。
5.ZmHDA101与AtTPL/TPRs的酵母双杂交互作研究。利用酵母双杂交技术,进行ZmHDA101与AtTPL/TPRs的互作研究。结果发现,相比于阴性对照,共转化酵母AD-ZmHDA101与BD-AtTPL、BD-AtTPR1、BD-AtTPR2、BD-AtTPR3、BD-AtTPR4组合以及BD-ZmHDA101与AD-AtTPL、AD-AtTPR1、AD-AtTPR2、AD-AtTPR3、AD-AtTPR4组合在酵母三缺培养基上均生长良好,表明ZmHDA101与AtTPL/TPRs家族基因均能在酵母细胞中直接互作。
1.玉米HDAC家族基因的生物信息学分析。对玉米HDAC家族基因的系统发育和结构域进行分析,发现玉米HDAC家族基因可分为5个亚家族(ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ、SRT和HD2),其中ClassⅠ、ClassⅡ、ClassⅢ亚家族均包含上乙酰转移酶特有的结构域HDAC,ZmHDA101属于ClassⅠ亚家族。利用生物信息学方法,对玉米HDAC家族基因的组织特异性、非生物胁迫和生物胁迫下表达分析,发现HDAC家族基因在玉米不同发育时期、不同组织以及响应不同非生物胁迫和生物胁迫过程中的表达水平表现出明显的差别。其中ZmHDA101基因在植株不同部位表达较为平稳,在高温、高盐胁迫下表达明显上调。推洲玉米HDAC家族基因参与玉米生长、发育和响应非生物和生物胁迫过程。
2.玉米HDAC家族基因在玉米响应水杨酸和茉莉酸激素过程中的表达规律分析。利用Real-time PCR技术,检测玉米HDAC家族基因在玉米响应水杨酸和茉莉酸激素过程中的表达情况,结果发现玉米HDAC家族基因在响应水杨酸、茉莉酸处理过程中呈现不同的规律。ZmHDA101基因在茉莉酸激素处理下呈现诱导上调的表达趋势,在水杨酸处理下呈现下调表达趋势,推测其参与茉莉酸和水杨酸的信号转导途径。
3.ZmHDA101的亚细胞定位分析。利用Gateway技术,构建了ZmHDA101与GFP融合表达的载体103-ZmHDA101。利用农杆菌介导的遗传转化方法,将103-ZmHDA101转化至烟草叶片细胞中进行瞬时表达,在激光共聚焦显微镜下观察到细胞核和细胞质膜上有GFP的绿色荧光信号,确定了ZmHDA101基因定位于细胞核和细胞质膜中。
4.ZmHDA101在玉米抗病过程中的功能研究。将ZmHDA101过表达植株接种禾谷镰孢、玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米圆斑病菌、玉米弯孢霉叶斑病菌,进行抗病性鉴定。结果发现,与玉米自交系B73相比,ZmHDA101过表达植株对试验接种的供试病原菌均表现出明显的抗性,表明ZmHDA101在玉米抗病过程中具有重要作用。利用Real-time PCR技术,检测玉米自交系B73、ZmHDA101过表达植株中PRs基因的表达水平。结果发现,在未接种和接种禾谷镰孢48h的ZmHDA101过表达植株中PRs基因的表达量均明湿低于自交系B73,表明ZmHDA101的过表达影响PRs基因的表达,进一步说明了ZmHDA101在玉米抵抗病菌侵染中发挥重要的作用。
5.ZmHDA101与AtTPL/TPRs的酵母双杂交互作研究。利用酵母双杂交技术,进行ZmHDA101与AtTPL/TPRs的互作研究。结果发现,相比于阴性对照,共转化酵母AD-ZmHDA101与BD-AtTPL、BD-AtTPR1、BD-AtTPR2、BD-AtTPR3、BD-AtTPR4组合以及BD-ZmHDA101与AD-AtTPL、AD-AtTPR1、AD-AtTPR2、AD-AtTPR3、AD-AtTPR4组合在酵母三缺培养基上均生长良好,表明ZmHDA101与AtTPL/TPRs家族基因均能在酵母细胞中直接互作。