研究背景随着人口老龄化程度加重,2型糖尿病(type2diabetesmellitus,T2DM)的发病率和患病率逐年升高,已成为威胁人民健康的重大社会问题。而糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)这一最常见、最严重的糖尿病慢性微血管并发症,又在很大程度上容易进展为终末期肾脏病(endstage renal disease,ESRD)。当前现代医学治疗DN的主要策略是在血糖和血压控制良好的前提下,提倡低蛋白饮食,并主张积极降低血脂和应用血管紧张素转化酶抑制剂或血管紧张素受体拮抗剂等药物进行干预。此类疗法确实能延缓糖尿病患者进展到DN的进程,但是仍较局限,不能完全阻断DN的疾病进展。因此,我们有必要进一步探讨DN发病过程中的分子生物学机制,为找到更理想的治疗方案打下基础。有研究认为,机体长期处于较高的血糖水平以及因此而导致的氧化应激和炎症反应是导致DN的重要机制。因此,积极探索阻断氧化应激,阻断活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)的继发损害,及抑制炎症反应是延缓及阻止DN进展的重要思路和方法。葡萄籽原花青素提取物(grape seed proanthocyanidin extract,GSPE)具有多种生物学活性。在GSPE中,葡萄籽原花青素B2(grapeseed proanthocyanidin B2,GSPB2)具有最强大的对抗炎症反应、减少细胞凋亡和减弱氧化应激等作用。GSPB2对2型糖尿病小鼠多个脏器有明确的保护作用,这一点我们已经在前期的实验中得到证明,但其对2型DN小鼠肾脏的保护作用及药理机制尚未完全阐明。本课题组前期应用 iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)定量标记蛋白质组学(proteomics)技术,探讨了 GSPB2干预后肾脏蛋白质组的质和量的变化。在蛋白质组学结果中,我们发现mimecan蛋白在DN中表达下调,GSPB2治疗后表达回调,提示该蛋白可能在DN发展中发挥一定作用。骨生成诱导因子(osteoinductive factor,OIF),是从牛的骨基质中提取出来的一种分泌蛋白,也被称为mimecan或osteoglycin(OGN),广泛表达于人体血管基质、心脏、卵巢、肺、肾脏等组织中。该因子已被证明具有调节胶原纤维形成以及癌细胞再生和分化等方面的作用。细胞外基质中的mimecan主要参与I型胶原的代谢调节,能够促进I型胶原的降解。因此我们推测,mimecan有可能参与DN疾病进展过程中血管病变,特别是微血管病变的发生发展,还有可能成为GSPB2治疗此类病变的药物作用靶点。研究表明,mimecan基因的第一个内含子中有核因子κB(nuclear factor-kappaB,NF-κB)的结合序列。NF-κB已被证明在引起炎症反应、调节机体免疫应答等方面发挥重要作用。我们推测NF-κB可能通过与mimecan基因上特异位点结合,导致血管内皮受损,加重对糖尿病肾脏的损害。这一理解可能为DN的防治提供新的方向和策略。在前期工作基础之上,我们提出科学假设:GSPB2可能通过影响NF-κB信号通路的活性改善DN的炎症反应及纤维化状态,从而对糖尿病肾脏起到保护作用。因此,本项目利用实验性DN动物模型,采用免疫印迹(western blot)技术方法,就mimecan蛋白的表达情况进行验证,并观察NF-κB蛋白的活性。应用免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察小鼠肾脏组织中纤维化因子及炎症因子的表达情况,初步探讨GSPB2治疗DN的作用是否与NF-κB通路有关,推测mimecan在DN发病中发挥作用的可能通路,及探求GSPB2对DN发挥治疗作用的可能机制,为GSPB2对DN的防治提供新的实验依据,为DN的临床及实验研究提供可靠的理论依据。研究目的1.验证GSPB2干预能否对db/db小鼠早期肾脏功能改变和组织病理改变产生良性影响。2.应用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定db/db小鼠与正常小鼠、db/db小鼠GSPB2治疗组与非治疗组肾脏差异表达的蛋白质,发现mimecan蛋白在DN中表达下调,GSPB2治疗后表达回调,证明该蛋白在DN的调节机制中可能发挥一定作用。3.应用western blot技术方法对差异蛋白mimecan的表达情况进行验证。4.应用western blot方法观察正常小鼠组、db/db小鼠组,及GSPB2治疗组小鼠的肾脏组织NF-κBp65蛋白表达情况,以揭示GSPB2对小鼠肾脏组织发挥保护作用的机制。5.应用免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察小鼠肾脏组织中促纤维化因子及炎症因子的表达情况。研究方法选取7周龄雄性C57BLKS/J db/db小鼠24只及7周龄雄性C57BLKS/Jdb/m小鼠12只进行实验。C57BLKS/Jdb/m小鼠12只作为正常对照组(CC),随机选取12只C57BLKS/Jdb/db小鼠作为DM组(DM),每日予生理盐水灌胃10周;12只为GSPB2干预组(DMT),以30mg/kg/d GSPB2灌胃10周。每周测小鼠体重。实验结束时,采用ELISA法测定小鼠24 h尿白蛋白排泄量。实验结束后,采下腔静脉血测定空腹血糖(FBG)、总胆固醇(TC)和甘油三醋(TG)、血浆糖基化终末产物(advanced glycation end products,AGEs)等指标;小鼠禁食12 h处死后,留取各组小鼠肾脏组织,部分进行PAS染色,观察病理变化,部分肾脏用于iTRAQ蛋白质组学分析和western blot分析。提取各组小鼠肾脏的组织总蛋白样本,进行差异蛋白的功能和定位分析以及生物信息学分析;另一部分提取到的组织总蛋白使用western blot的方法进行验证各组小鼠中mimecan蛋白的表达情况。一部分肾脏组织用于提取组织核蛋白,提取到的核蛋白用westernblot的方法检测各组小鼠肾脏组织中NF-κBp65蛋白表达情况。免疫组化法、RT-PCR法及westernblot法观察小鼠肾脏组织中促纤维化的转化生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)、胶原 I(collagen I,COL I)、αα-血管平滑肌肌动蛋白(αα-Smooth muscleαctin,α-SMA)及炎症因子IL-6、TNF-α的表达。研究结果1.一般观察:CC组小鼠状态良好,毛发光亮,性情好动,活动灵敏,反应迅速。DM组小鼠多食、多饮、多尿,体重明显增加,皮毛蓬松,毛光暗淡,反应慢,动作缓。GSPB2治疗后db/db小鼠上述表现较DM组小鼠有所减轻。GSPB2治疗2周后糖尿病小鼠的体重开始降低(p<0.05),但仍高于CC组(p<0.05)。2.GSPB2对小鼠FBG、TG、TC、AGEs、24h尿白蛋白定量的影响:实验结束时,DM组小鼠FBG、TG、TC、AGEs水平及24h尿白蛋白排泄量显著高于CC组小鼠,GSPB2治疗后显著降低db/db小鼠的TG、TC、AGEs水平及24h尿白蛋白排泄量(p<0.05),但是对FBG无明显影响(p>0.05)。3.GSPB2干预对db/db小鼠的肾脏病理形态的影响:与正常小鼠肾脏组织相比,DM组小鼠肾小球体积明显增大,系膜区显著增宽,系膜细胞增生,系膜基质聚集,肾小球基底膜呈弥漫性增厚;GSPB2治疗后,肾小球肥大、系膜区增宽及肾小球基底膜增厚程度均改善。4.小鼠肾脏iTRAQ蛋白质组学分析结果:mimeCan表达水平在DM组明显下降,经GSPB2治疗后,表达量较DM组小鼠明显上升。5.免疫印迹法检测小鼠肾脏组织中mimecan蛋白表达的结果:与正常对照组小鼠比较,mimecan在DM组表达明显下降(p<0.05),应用GSPB2治疗后,mimecan的表达上升(p<0.05),该结果与iTRAQ鉴定结果一致。6.GSPB2对db/db小鼠肾脏NF-κBp65蛋白表达的影响:提取各实验小组小鼠的肾脏组织,并对细胞核蛋白进行western blot检测,发现与正常组小鼠相比,DM组db/db小鼠肾脏NF-κBp65的蛋白表达明显上调,两组之间有明显差异(p<0.05)。GSPB2治疗后,肾组织NF-κBp65蛋白表达下调(pp<0.05),但未恢复到正常水平(p<0.05)。7.免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察到糖尿病肾病小鼠肾脏组织中促纤维化因子TGF-β、COLI、α-SMA及炎症因子IL-6、TNF-α的表达升高,GSPB2治疗后表达回调。结论1.GSPB2治疗10周可明显改善db/db小鼠的一般状态,减轻db/db小鼠的体重,降低db/db小鼠的血清甘油三酯、胆固醇水平,改善脂质代谢紊乱。GSPB2显著降低db/db小鼠的血清AGEs水平,减少24h尿白蛋白量,减轻糖尿病所致的肾脏损害,并改善db/db小鼠的肾功能。从微观角度来看,GSPB2能抑制糖尿病小鼠肾小球病态肥大、减缓基底膜异常增厚和系膜区过度扩张,改善糖尿病所致的肾组织病理损害,且效果均十分显著。2.iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的小鼠肾脏表达的差异蛋白经定量分析,发现,mimecan表达水平在DM组明显下降,经GSPB2治疗后,表达量较DM组小鼠明显上升。经免疫印迹法验证小鼠肾脏组织中mimecan蛋白表达的情况与蛋白质组学分析结果一致。并且通过免疫组化法、RT-PCR法及western blot法观察到糖尿病肾病小鼠肾脏组织中促纤维化因子TGF-β、COLI及α-SMA的表达升高,GSPB2治疗后表达回调,提示GSPB2的抗纤维化作用。3.Mimecan可能通过调控NF-κB的信号通路参与DN的发生发展。GSPB2可能通过抑制db/db小鼠肾脏NF-κBp65的蛋白表达来改善糖尿病小鼠肾脏的纤维化及炎症状态。4.免疫组化法、RT-PCR法及western blot法证实糖尿病肾病小鼠肾脏组织中炎症因子IL-6、TNF-α的表达升高,GSPB2治疗后表达回调,再次验证GSPB2的抗炎症作用。意义本研究采用国内外公认的C57BLKs/Jdb/db鼠作为2型DN的动物模型。研究发现,GSPB2能明显减轻体重,降低血脂,减轻尿白蛋白排泄,减少体内AGEs的含量,明显改善糖尿病肾脏病的病理损害,提示GSPB2具有保护糖尿病小鼠肾功能的作用,其机制可能与GSPB2提高糖尿病小鼠体内抗氧化能力,降低机体氧化水平有关。我们课题组采用iTRAQ蛋白质组学技术鉴定出的糖尿病肾脏差异蛋白质中,发现mimecan蛋白在db/db小鼠肾脏中表达水平明显降低;GSPB2治疗10周后,mimecan蛋白的表达水平明显增加。本研究用western blot的方法检验了各实验组小鼠的肾脏中mimecan蛋白的表达特点,与iTRAQ结果一致。本研究中蛋白质组学、免疫组化、RT-PCR及western blot分析结果均提示在DN小鼠中,降低的mimecan蛋白加重了肾功能的恶化,并引起小鼠的肾小球体积增大,系膜细胞增多伴系膜基质增生,肾小球基底膜弥漫增厚,提示糖尿病时降低的mimecan蛋白对I型胶原的降解下降,加重了肾脏的纤维化状态。GSPB2治疗后,回调的mimecan蛋白可增加对I型胶原的降解,减轻肾小球基底膜的增厚,减轻肾小球体积的增大,同时减低纤维化因子的表达,起到保护肾脏的作用,与我们的病理结果一致。许多研究已经证实炎症在DN的发病机制中起着关键的作用,然而,NF-κB与DN之间的关系,以及经GSPB2治疗的糖尿病小鼠肾脏中NF-κB的水平至今尚未见报道。我们的研究提示,在db/db小鼠的肾脏细胞核中,NF-κB p65的水平升高,提示核因子NF-κB是被激活的,并且激活的NF-κB进入细胞核内参与了高糖诱导的小鼠肾脏纤维化,同时检测到糖尿病肾病时炎症因子IL-6、TNF-α的表达是升高的。经过GSPB2治疗后,NF-κB p65、IL-6、TNF-α的水平下降,提示GSPB2能够抑制NF-κB介导的炎症反应及肾脏纤维化。本研究证实,NF-κB与糖尿病及其纤维化的关系密切,而且,GSPB2能有效的抑制糖尿病时的氧化应激及炎症反应。我们推测,在糖尿病小鼠的肾脏组织中,降低的mimecan蛋白可能部分的通过增加NF-κBp65的水平来诱导肾脏纤维化的。而GSPB2所诱导的mimecan蛋白表达回调,至少部分与对NF-κB p65通路的抑制有关。由以上所述内容可见,氧化应激和炎症广泛存在于糖尿病状态下机体的肾脏中,且两者共同促进DN的发生发展。降低的mimecan可激活NF-κB信号通路,加重糖尿病肾脏炎症、氧化应激及纤维化。GSPB2通过抑制NF-κB信号通路的过度激活,缓解db/db小鼠肾脏组织中的氧化应激状态、炎症状态及纤维化程度,从而减慢乃至杜绝DN的发生及病情进展,对糖尿病小鼠的肾脏组织具有保护作用。研究背景糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最常见的慢性微血管并发症,是糖尿病患者死亡的主要原因。有关DN发病机制的研究,人们早先关注的是肾脏系膜基质堆积和肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)增厚,但是针对上述因素的干预策略尚不能有效抑制DN的进展,所以更深入的研究DN发病的其他机制,对于寻找新的药物治疗靶点具有重大意义。DN早期最突出的临床表现为肾小球高滤过性和尿白蛋白排泄率的增加,肾小球滤过屏障的异常改变是造成以上症状的关键原因。肾小球滤过屏障的结构和功能变化,特别是足细胞在DN中的作用,近年来逐渐成为人们关注和研究的热点。足细胞(podocyte)是附着在GBM外侧的肾小囊脏层上皮细胞,在维持肾小球内环境稳态中起重要作用,它与肾小球内皮细胞和基底膜一起构成了肾小球滤过屏障。足细胞损伤是DN的早期事件,可导致滤过屏障遭到破坏,产生蛋白尿,加重肾脏损伤。足细胞损伤主要是足细胞凋亡所致的密度和数量减少,但是,在DN中造成足细胞损伤的机制尚不完全明确,因此研究足细胞凋亡机制将为DN的发生与治疗提供研究基础和理论依据。miRNA是近年来发现的一类内源性、非编码的单链小RNA,通过与其靶基因的3’非翻译区(3’-UTR)碱基互补配对结合,在转录后水平直接导致mRNA的降解和(或)翻译过程的抑制,负性调控靶基因蛋白的表达,在生物体的发育分化、器官形成、细胞增殖、凋亡甚至疾病的发生中发挥重要的作用,已成为近年来研究的热点。目前,越来越多证据表明miRNA的异常表达与DN的发生、发展密切相关。研究发现,肾脏组织中的miRNAs存在其独特的表达谱,miR-192、miR-194、miR-204、miR-215 和 miR-216 的表达水平相对高于在其他组织的表达水平。目前已有研究报道了 miR-192、miR-194、miR-215和miR-216在DN发生发展中的作用及具体机制,但是关于miR-204在DN中的功能还未见报道。有研究发现miR-204和糖尿病以及糖尿病视网膜病变发病相关,因此本研究拟对miR-204在DN中的表达情况及其靶点进行分析,并探讨miR-204在DN中的作用机制。本研究围绕内分泌疾病中的难点及重点—糖尿病肾病发生的分子机制进行选题,以DN小鼠动物模型、DN患者和高糖培养的小鼠足细胞为研究载体,通过 RT-PCR、western blot、Luciferase 分析等方法,研究了 DN 中 miR-204 的表达水平并验证了其靶点为B型淋巴瘤细胞-2(Bcl-2);然后在细胞水平上通过流式细胞术等方法研究了 miR-204通过调控Bcl-2调节足细胞凋亡的分子机制;最后在DN小鼠模型中通过外源性给予miR-204反义寡核苷酸过表达慢病毒探讨了 miR-204对DN进展的影响及可能机制,为进一步拓展研究DN的早期特异性诊断和治疗提供了理论依据。研究目的1、分析miR-204在DN小鼠、DN患者及高糖培养下足细胞中的表达情况。2、预测及验证miR-204作用靶标,检测DN患者肾组织中靶基因的表达情况,并用miR-204 mimics/inhibitors转染足细胞,观察靶基因mRNA及蛋白的表达情况,为进一步探讨miR-204在DN发生机制中的作用提供基础。3、流式细胞术研究miR-204对足细胞凋亡的影响,并用蛋白免疫印记法观察miR-204 mimics/inhibitors转染的足细胞中凋亡相关蛋白的表达情况,探讨miR-204调节足细胞凋亡的分子机制。4、构建DN小鼠模型,观察miR-204在体内的作用。研究方法穿刺采集2015年11月至2017年1月期间入院的59名糖尿病患者(其中31名为DN,28名非DN患者)的肾脏样本。采用小剂量多次腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)的方法制备小鼠DN模型,分别在DBA/2小鼠10周龄和15周龄时连续腹腔注射STZ 5天,每天剂量50 mg/kg体重,测定血糖,血肌酐,尿素氮,24小时尿微量白蛋白情况。高糖(葡萄糖浓度为30 mmol/L)培养足细胞,通过RT-PCR技术分析DN患者、DN小鼠及高糖环境下足细胞中miR-204的表达变化。应用TargetScan、PicTar和miRanda三个miRNA在线靶点预测软件对其作用靶标进行预测,并通过Luciferase分析验证确定已预测靶标。在足细胞中利用 miR-204 mimics/inhibitors 来上调或下调 miR-204,通过 RT-PCR 及western blot方法检测对Bcl-2 mRNA和蛋白表达水平的影响。利用miR-204 mimics/inhibitors转染高糖培养的足细胞,通过AnnexinV-FITC/PI双染法检测miR-204对足细胞凋亡的影响,并进一步通过免疫印迹法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和caspase-3表达情况来研究miR-204作用的分子机理。再次通过STZ诱导建立小鼠DN模型。建模成功后,将miRNA-204ASO过表达慢病毒通过尾静脉注射到DN模型小鼠体内,连续注射2周,治疗结束后取小鼠肾脏进行PAS染色观察肾脏形态学改变;并通过RT-PCR检测miRNA-204在肾组织中的表达,western blot检测肾脏组织中Bcl-2蛋白的表达情况。研究结果1、DN小鼠肾脏组织miR-204的表达量较正常小鼠显著升高,约为正常小鼠的1.64倍。DN患者肾脏组织miR-204的表达较非DN的糖尿病患者显著升高,约为非DN的2.06倍。在高糖培养的足细胞中,miRNA-204的表达量比低糖培养组高约2.2倍,差异显著(p<0.05)。2、预测并验证miR-204的靶点mRNA为抗凋亡蛋白Bcl-2。3、DN患者肾脏组织中Bcl-2 mRNA的表达量较非DN糖尿病患者显著降低,非DN组约为DN组的1.67倍,并且miR-204的表达量与Bcl-2 mRNA的表达量呈显著负相关。4、和对照组相比,足细胞中过表达miR-204可显著抑制Bcl-2 mRNA及蛋白的表达量(p<0.05);反之,下调miR-204表达后Bcl-2 mRNA及蛋白的表达量则显著增加(p<0.05)。5、流式细胞术结果显示错配序列组的足细胞凋亡率和空白对照组相当;和错配组相比,miR-204mimics可以诱导足细胞凋亡,而miR-204抑制剂则可保护足细胞免于凋亡(p<0.05)。Western Blot结果显示,和对照组相比,miR-204 mimics可以抑制足细胞中Bcl-2蛋白表达,caspase3蛋白相应增加,miR-204抑制剂的作用与之相反。6、DN模型造模成功后将miRNA-204ASO过表达慢病毒注入小鼠体内,取小鼠肾脏组织PAS染色观察,DN组系膜基质增生,系膜细胞增生,肾小球及肾小管上皮肿胀;错配对照组同DN组变化;miR-204ASO组肾小球系膜基质增生及肾小球肿胀不明显。RT-PCR结果显示,注入miRNA-204ASO过表达慢病毒后,miRNA-204的表达比注入错配序列病毒组和DN模型组低,差异有显著性(p<0.05);蛋白免疫印记法观察到在DN小鼠肾组织中,Bcl-2蛋白的表达明显降低,注入miRNA-204ASO过表达慢病毒后,Bcl-2蛋白的表达升高,差异有显著性(p<0.05)。研究结论1、miR-204的表达情况:miR-204在DN模型小鼠肾脏、DN患者的肾脏组织及高糖培养下的足细胞中表达水平均显著升高,初步证实miR-204参与了 DN的发病过程。2、miR-204的靶点预测及验证:应用在线靶基因预测软件预测及荧光素酶报告载体证实Bcl-2是miR-204的靶基因。RT-PCR检测了 DN患者肾脏组织Bcl-2的mRNA的表达水平明显低于非DN对照组,且miR-204的表达量与Bcl-2 mRNA的表达量呈显著负相关。在体外培养的足细胞中,过表达miR-204能够明显抑制足细胞Bcl-2 mRNA和蛋白的表达;抑制miR-204可显著增加Bcl-2 mRNA和蛋白的表达。以上结果提示miR-204可能通过调控Bcl-2的表达参与DN的发生发展。3、miR-204的功能检测:AnnexinV-FITC/PI双染法表明miR-204促进足细胞凋亡。蛋白免疫印迹显示,在体外培养的足细胞中,miR-204 mimics能够使Bcl-2蛋白表达受到抑制,caspase 3蛋白表达增加;而miR-204 inhibitors作用相反。研究结果证实miR-204通过抑制Bcl-2促进足细胞凋亡。4、miR-204在DN小鼠中的调节作用:PAS染色结果显示,miR-204ASO过表达慢病毒注入后DN小鼠肾小球系膜基质增生及肾小球肿胀较DN组明显改善。RT-PCR及western blot结果显示:通过尾静脉注入miRNA-204ASO过表达慢病毒后,DN小鼠肾组织miRNA-204表达水平下降,Bcl-2蛋白的表达明显升高。提示miR-204可以通过靶向下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达促进足细胞凋亡,增加DN的发病风险。研究意义本研究紧密结合DN发生的分子机制,利用DN患者、DN小鼠模型及小鼠肾小球足细胞,系统探讨了 DN肾脏组织及足细胞中miR-204的表达水平及通过抑制Bcl-2途径介导的DN发生和发展中的作用机制,为进一步探索miR-204靶向治疗DN提供了理论基础。本研究从体外细胞水平和体内动物实验分别探讨了 miRNA-204在DN发生发展中的调控机制,预测miRNA-204有望成为DN潜在的生物学标志以及治疗靶点。本课题发现了 miR-204在DN肾脏组织中存在差异表达,证实miR-204参与了 DN发生的分子机制;成功预测并验证了 Bcl-2为miR-204的靶基因;在细胞水平上初步证实miR-204可通过靶向抑制Bcl-2来调控足细胞凋亡,促进DN的发生发展;发现在DN模型小鼠体内miR-204 ASO过表达慢病毒可特异性靶向调控Bcl-2的信号传导,延缓甚至阻断小鼠DN的进展。本研究发现,miR-204可以通过靶向下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达促进足细胞凋亡,增加DN的发病风险。因此,miR-204可能是一个新的糖尿病肾病的潜在治疗靶点。